A STUDY OF THE POSSIBILITY OF USING PAPAIN AND BETA-GLUCANASE TO PRODUCE YEAST HYDROLYSATE

Research article
DOI:
https://doi.org/10.23670/IRJ.2024.139.99
Issue: № 1 (139), 2024
Suggested:
19.12.2023
Accepted:
22.01.2024
Published:
24.01.2024
132
4
XML
PDF

Abstract

The article focuses on the production of microbial proteins (Single-Cell Proteins, SCP) using the yeast Saccharomyces cerevisiae. This approach has a great promise in food fortification and animal protein replacement. The advantage of SCP is the minimal use of water and land resources and reduced waste generation.

An enzymatic method of yeast cell wall degradation for the production of protein isolates is proposed. The enzymes papain and bromelain were found to increase the dry matter yield of yeast hydrolysate. From a given set of enzymes, the highest protein yield could be observed in the combination of papain at a dosage of 1% and beta-glucanase at a dosage of 0.03%. The protein yield in this sample was 1.51%, which is 3.5 times higher than the protein yield in samples using the combination of pepsin and beta-glucanase enzymes. The yield of hydrolysed protein, relative to the original protein, ranged from 9.8 to 37.5%.

1. Введение

Начиная с 2020 года, на фоне пандемии вопрос глобального дефицита белка в человеческом рационе стал снова актуальным. Продовольственная и сельскохозяйственная организация Объединенных Наций в своем докладе сообщила об ожидаемой нехватке богатой белком пищи на рынке

. К счастью, продовольственного кризиса удалось избежать, однако, учитывая растущее население нашей планеты, необходимо развивать альтернативные пути получения высококачественного и пригодного для употребления белка.

Одним с таких способ является производство одноклеточных белков или Single-cell Proteins (SCP) – экстрактов биомассы чистых или смешанных культур водорослей, грибков или дрожжей. Полученный таким способом белок может быть использован как ингредиент для обогащения пищевых продуктов или замены животного белка. Выгодным отличием от традиционных способов получения богатых белком продуктов, например животноводства, являются отсутствие потребности в интенсивном использовании водно-земельных ресурсов, и значительно меньшее количество отходов

.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae благодаря своей доступности и химическому составу (рис. 1) являются подходящим вариантом для получения белкового изолята.

Приблизительное процентное содержание веществ в дрожжевой клетке

Рисунок 1 - Приблизительное процентное содержание веществ в дрожжевой клетке

Дрожжевая клетка в среднем на 70-75% состоит из воды, сухие вещества занимают оставшиеся 25-30%. До 95% сухих веществ в клетке составляют органические вещества, в то время как на долю неорганических веществ приходится до 10% от объема сухих веществ. Органические вещества в дрожжевой клетке представлены азотсодержащими веществами и углеводами (гликоген и трегалоза). Перечень аминокислот, содержащихся в дрожжах, в сравнении с другими источниками, представлен в таблице 1
.

Таблица 1 - Содержание аминокислот

Аминокислоты

Дрожжи Sacch. cerevisiae

Творог, мг/100 г продукта

Телятина 1-й категории, мг/100 г продукта

Незаменимые, мг/100 г продукта

4802

7680

7626

Валин, мг/100 г продукта

698

990

1156

Изолейцин, мг/100 г продукта

741

1000

998

Лейцин, мг/100 г продукта

903

1850

1484

Лизин, мг/100 г продукта

913

1450

1683

Метионин, мг/100 г продукта

233

480

414

Треонин, мг/100 г продукта

644

800

855

Триптофан, мг/100 г продукта

174

180

245

Фенилаланин, мг/100 г продукта

496

930

791

Заменимые, мг/100 г продукта

5785

10270

12333

Алин, мг/100 г продукта

366

440

1124

Аргинин, мг/100 г продукта

528

810

1278

Аспарагиновая кислота, мг/100 г продукта

684

1000

1844

Гистидин, мг/100 г продукта

302

560

739

Глицин, мг/100 г продукта

465

260

948

Глутаминовая кислота, мг/100 г продукта

1570

3300

3329

Пролин, мг/100 г продукта

490

2000

1333

Серин, мг/100 г продукта

583

820

813

Тирозин, мг/100 г продукта

676

930

689

Цистин, мг/100 г продукта

121

150

236

Принципиальная схема получения белкового изолята включает в себя следующие обязательные этапы: экстрагирование белков; осаждение белка в изоэлектрической точке рН; центрифугирование; концентрация и очистка белка, промывка и сушка

. Экстрагирование белков из биомассы возможно только после разрушения клеточной стенки. Разрушение может быть осуществлено физическим, химическим и ферментативным способом. В рамках данного исследования внимание было сосредоточено на получении белковых изолятов с использованием ферментативного способа разрушения клеточных стенок.

Процесс естественного автолиза дрожжевых клеток, продолжительность которого может составлять от двух суток до 2 месяцев, обусловлен активностью собственных ферментов, включая протеолитические, гидролитические и оксиредуктазы

. В контексте этого процесса, дополнительное внедрение внешних ферментов, таких как папаин, получаемый из плодов папайи, и бромелаин, извлекаемый из стеблей и плодов ананаса, может дополнительно ускорить ферментативный гидролиз клеточных структур дрожжей. Папаин, как протеолитический фермент, эффективно разрушает белковые связи, в то время как бромелаин, содержащий смесь протеаз, амилаз и липаз, дополнительно активен в гидролизе белковых компонентов
. Этот интегрированный подход может оптимизировать выход белка и улучшить процесс ферментативного гидролиза, способствуя получению дрожжевого изолята с желаемыми свойствами.

Клеточная стенка дрожжей состоит примерно на 40% из маннанопротеинов, на 60% из глюканов и на 2% из хитина (таблица 2)

.

Таблица 2 - Компоненты клеточной стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Компоненты клеточной стенки

Количество, % от КС

Основной тип связи

Степень полимеризации

Mr, кДа

Число молекул х106 на клетку

Маннанопротеины

40

α1,6 + α1,3 + α1,2

-

От <10 до >450

2,6

Глюкан:

-

β1,3

-

-

-

щелочерастворимый

20

β1,3

1500

243

2,5

щелоче/кислотонерастворимый

35

β1,3

1500

243

4,3

щелоченерастворимый, кислоторастворимый

5

β1,6

140

23

6,6

Хитин

2

β1,4

-

-

-

В реакции гидролиза есть одна, важная для понимания процесса, деталь – при расщеплении пептидной связи, добавляется одна молекула воды. Это значительно сказывается на составе сухого вещества конечного продукта, поскольку он зависит от степени гидролиза. Если белковый изолят, с содержанием белка 90% в сухом веществе, гидролизуют с DH = 25%, то на каждые четыре аминокислоты приходится одна молекула воды, что соответствует 18/(4*128) = 3,5% воды будет добавлено в смесь. Конечная смесь в таком случае будет содержать 86,5% белка в пересчете на сухое вещество. Это может привести к противоречию с определениями изолятов, которые обычно определяются как содержащие не менее 90% белка в пересчете на сухое вещество

.

2. Методы и принципы исследования

В ходе эксперимента использовались прессованные хлебопекарные дрожжи «Люкс Экстра» (ООО «Саф-Нева», Россия), сухие ферменты пепсин, трипсин, папаин, бромелаин и жидкая бета-глюканаза. Протеолитические ферменты пепсин, трипсин, папаин и бромелаин на первом этапе, с последующим внесением бета-глюканазы во все образцы.

Пепсин (код фермента 3.4.23.1) – эндопептидаза, протеолитический фермент, принадлежит к классу гидролаз. Трипсин (код фермента 3.4.21.1) – фермент группы сериновых протеаз, способный расщеплять пептиды и белки, а также сложные эфиры. Папаин (код фермента 3.4.22.2) фермент является монотиоловой цистеиновой эндопротеазой, по своему действию схож с пепсином, однако действует как в кислых, так и в щелочных средах (рН 3-12) и проявляет амидазную/трансамидазную а также эстеразную/трансэстеразную активность. Бромелаин (код фермента 3.4.22.32) – цистеиновые протеиназы (эндопептидазы), растворим в воде. Бета-глюканаза (код фермента 3.2.1.6) – фермент способен расщеплять 1,3 и 1,4 гликозидые связи β-глюканов и других полисахаридов

,
,
,
. Характеристика ферментов представлена в таблице 3.

Таблица 3 - Характеристика выбранных ферментов

Название

Оптимум рН

Оптимальная t, °С

t инактивации, °С

Пепсин

1,5-2,0

25-30

60

Трипсин

7,8-8,0

45-50

50

Папаин

5,0-7,0

60

80

Бромелаин

5,0-8,0

50-60

80

Бета-глюканаза

4,5-5,5

50-55

80

Измерения сухих веществ (СВ) производились рефрактометрическим методом на автоматическом рефрактометре модели PTR 46X (Index Instruments Ltd., Великобритания) в конце каждой инкубации и после конечного центрифугирования. Измерение рН проводилось потенциометрическим методом на автоматическом титраторе 848 Titrino Plus (Metrohm, Швейцария). Содержание белка в конечном продукте измерялось по методу Кьельдаля

.

В рамках эксперимента готовилась 10% дрожжевая суспензия прессованных хлебопекарных дрожжей, из которой формировалось 12 образцов с различными дозировками каждого из протеолитических ферментов. Для каждого фермента были выбраны три дозировки – минимальная, средняя и максимальная (таблица 4), итого получили 12 вариаций (таблица 5).

Таблица 4 - Дозировки внесения протеолитических ферментов

Фермент

Минимальная дозировка, %

Средняя дозировка, %

Максимальная дозировка, %

Папаин

0,01

0,5

1

Трипсин

Пепсин

Бромелаин

После этого образцы инкубировались на водяной бане в течение 120 минут при оптимальной температуре и уровне рН (таблица 3), затем инактивировались при 80°С в течение 15 минут. Далее вносился фермент бета-глюканаза в дозировке 0,03% и инкубировался в течение 120 минут при температуре 55°С с последующей инактивацией при 80°С в течение 15 минут. Затем раствор центрифугировался при 6000 об/с в течение 10 минут. Из жидкой фазы белок осаждался в изоэлектрической точке рН 4,5 и осадок высушивался при температуре 40-50°С в течение 120 минут.

Параллельно готовился контрольный образец по способу экстракции этанолом. В 10% дрожжевую суспензию добавлялся 96% этанол в количестве 1,5%. Этот раствор в дальнейшем инкубировался при температуре 70°С и рН 5,5 в течение 255 минут, что равняется времени инкубации образцов с ферментами, затем подвергался кипячению в течение 15 минут. Далее образец центрифугировался при 6000 об/с в течение 10 минут. Из жидкой фазы белок осаждался в изоэлектрической точке рН 4,5 и осадок высушивался при температуре 40-50°С в течение 120 минут.

Конечные образцы были проанализированы по методу Кьельдаля для выявления содержания сырого протеина.

Математическая обработка данных производилась с использованием программы Microsoft Excel.

3. Основные результаты

Результаты показателей сухих веществ и рН в образцах дрожжевого гидролизата после ферментативной обработки представлены в таблице 5 и на рисунке 2.

Таблица 5 - Динамика изменения показателей в образцах дрожжевого гидролизата

Фермент

Дозировка, %

Начальный рН раствора

СВ после первой инкубации, %

СВ после второй инкубации, %

СВ после центрифугирова-ния, %

Конечный рН раствора

Папаин

0,01

5,2

0,5

1,3

2,2

6,4

Папаин

0,50

5,2

1,7

3

3,5

6,1

Папаин

1,00

5,2

2,2

3,3

4,2

5,8

Бромелаин

0,01

5,2

0,2

0,5

1,4

6,4

Бромелаин

0,50

5,2

0,7

1,2

2,6

6,5

Бромелаин

1,00

5,2

1,3

1,6

2,9

6,6

Пепсин

0,01

2

0,2

0,5

1,4

4,3

Пепсин

0,50

2

0,5

1

1,8

4,2

Пепсин

1,00

2

1,4

1,5

2,2

4,3

Трипсин

0,01

8

0,6

1

1,6

6,5

Динамика изменения массовой доли сухих веществ

Рисунок 2 - Динамика изменения массовой доли сухих веществ

Результаты демонстрируют, что после каждой инкубации и после центрифугирования при использовании ферментов количество сухих веществ в дрожжевом гидролизате увеличивается. Кроме того, увеличение дозировки всех выбранных ферментов также увеличивает количество сухих веществ в конечном растворе. Самый высокий показатель сухих веществ 4,2% был получен после центрифугирования при добавлении фермента папаина в дозировке 1%. Что в 1,9 раз больше, чем при внесении папаина в дозировке 0,01%. Использование ферментов бромелаина, пепсина и трипсина также повышает выход сухих веществ и увеличивает рН конечного раствора, за исключением фермента трипсина, который, наоборот, снижает рН.

Показатели сухих веществ и рН образца по способу экстракции этанолом представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Динамика изменения показателей в образце с этанолом

Реагент

Дозировка, %

СВ после инкубации, %

СВ после центрифугирования, %

Конечный рН раствора

Этанол

1,5

0,6

1,8

6,2

Данные в таблице показывают, что контрольный образец без добавления ферментов имеет более низкие показатели сухих веществ после инкубации и центрифугирования.

Результаты измерения содержания сырого протеина в образцах гидролизата представлены в таблице 7 и на рисунке 3.

Таблица 7 - Содержание сырого протеина в образцах

Наименование образца

Количество образца, мл

Титранта, мл

Азот (N), мг

Азот (N)/ 100 г, мг

Азот (N), %

Белок, %

Папаин 1%

25,0000

43,944

61,552

246,207

0,246

1,539

Папаин 1%

25,0000

44,688

62,595

250,379

0,250

1,565

Пепсин 1%

25,0000

12,548

17,576

70,303

0,070

0,439

Пепсин 1%

25,0000

11,947

16,734

66,936

0,067

0,418

Этанол 1,5%

25,0000

11,529

16,149

64,596

0,065

0,404

Этанол 1,5%

25,0000

10,739

15,041

60,166

0,060

0,376

Содержание сырого протеина в гидролизатах

Рисунок 3 - Содержание сырого протеина в гидролизатах

С учетом влажности дрожжей и разведением стартового гидромодуля (1:10) содержание белка в гидролизатах, в пересчёте на абсолютно сухое вещество, составил:

– При экстракции этанолом 4,88%;

– При экстракции с использованием пепсина 5,36%;

– При экстракции с использованием папаина 18,75%.

При учете того, что усреднённое содержание белка, в пересчёте на абсолютно сухое вещество, составляет 50%, то мы имеем следующий выход очищенного микробного белка, относительно исходного негидролизованного:

– При экстракции этанолом 9,8%;

– При экстракции с использованием пепсина 10,7%;

– При экстракции с использованием папаина 37,5%.

Целевым показателем содержания микробного белка после гидролиза, на данный момент, по мнению исследователей является 50%

,
. В связи с этим полученный результат можно охарактеризовать, как вызывающий умеренный оптимизм.

4. Заключение

В результате экспериментов выявлено, что использование протеолитических ферментов папаина и бромелаина увеличивает выход сухих веществ в дрожжевом гидролизате. Из заданного набора ферментов наибольший выход белка можно наблюдать в комбинации ферментов папаина в дозировке 1% и бета-глюканазы в дозировке 0,03%. Выход сырого протеина в этом образце составил 1,51%, что в 3,5 раз больше, чем выход белка в образцах с использованием комбинации ферментов пепсина и бета-глюканазы. Также стоит отметить, что рН раствора после всех манипуляций повышается в среднем на 1,45 пункта, за исключением использования фермента трипсина.

Выход гидролизованного белка, относительно исходного варьируется от 9,8 до 37,5%, что, при целевом показателе 50%, можно считать приемлемым.

Исходя из имеющихся результатов, в дальнейшем планируется:

а) изучить существующие протеолитические ферменты с оптимальным уровнем рН и температурой близким к оптимальным для естественного автолиза дрожжей, с целью подобрать комбинацию ферментов способных ускорить процесс естественного гидролизата и повысить выход питательных веществ;

б) подобрать наилучший температурный режим для такой комбинации ферментов;

в) подобрать подходящий способ очистки белка в полученном дрожжевом экстракте для получения белкового изолята с содержанием белка 80%.

Исследование подтверждает, что дрожжи Saccharomyces cerevisiae, благодаря их химическому составу и доступности, представляют собой перспективный источник белкового изолята. Этот подход может быть ключевым элементом в разработке эффективных и устойчивых методов получения белка, отвечающих растущим потребностям нашего общества.

Article metrics

Views:132
Downloads:4
Views
Total:
Views:132