LABORATORY METHODS FOR ASSESSING MICROBIOTA AND INNATE IMMUNITY FACTORS IN THE MUCOSA OF THE RESPIRATORY TRACT OF NEWBORNS WITH INFECTIOUS AND INFLAMMATORY PATHOLOGY

Изучение патогенеза и диагностических подходов к ИВП новорожденных требует глубокого понимания клинических, микробиологических и иммунологических характеристик данной нозологии. Иммунные дисфункции, способствующие развитию инфекционного процесса, могут быть детерминированы как на уровне новорожденного, так и на уровне материнского организма. На сегодняшний день отсутствует единая концептуальная модель развития ИВП дыхательных путей

Существует множество этиопатогенетических механизмов, способных вызвать внутриутробную инфекцию (ВУИ) и/или развитие инфекционных заболеваний в раннем неонатальном периоде (РНП)

Новорожденные подвержены развитию инфекционных осложнений по двум основным причинам: специфике госпитальных микроорганизмов и особенностям их собственной иммунной системы

Иммунная защита младенцев ещё не полностью сформирована, что ограничивает их способность адекватно реагировать на факторы окружающей среды, особенно на инфекции. Эта уязвимость особенно актуальна для детей, живущих в густонаселенных городских условиях, где контакты между людьми и присутствие патогенов более вероятны

Иммунитет доношенного здорового новорожденного по своей природе имеет некоторые особенности, которые позволяют описывать его как состояние физиологической недостаточности иммунных механизмов

Слизистая оболочка дыхательных путей выступает как первичный физиологический щит, реагирующий на вторжение патогенных микроорганизмов. Она активно участвует в работе местного, мукозального, врожденного иммунитета, что особенно важно в начальный период после рождения

Ключевыми элементами врожденного иммунитета, отвечающими за идентификацию патогенов, являются Toll-подобные рецепторы (TLRs), цитокины, антимикробные пептиды и другие молекулы.

Процесс активации врожденного иммунитета инициируется распознаванием общих, консервативных структур патогенов (паттернов), которые воспринимаются Toll-подобными рецепторами. Идентификация микробных агентов служит фундаментальным процессом в иммунном ответе, сопровождающимся развитием воспаления

Особый интерес представляет изучение TLR2 и TLR4, которые играют центральную роль в распознавании бактериальных липополисахаридов и липопептидов. Активация этих рецепторов приводит к активации внутриклеточных сигнальных путей, в частности, транскрипционного фактора NF-kB. NF-kB, в свою очередь, регулирует экспрессию множества генов, кодирующих провоспалительные цитокины, такие как TNF-α, которые играют важную роль в развитии воспалительной реакции и привлечении других иммунных клеток к очагу инфекции.

Среди защитных соединений, синтезируемых эпителиальными клетками дыхательных путей, особое место занимают антимикробные пептиды (AMPs), такие как HBD-1 и HBD-2. Эти пептиды обладают прямым бактерицидным действием, а также могут модулировать воспалительный ответ. Их роль в защите слизистых оболочек от патогенов неоспорима. Однако, на разных этапах развития человека, включая период новорожденности, уровень экспрессии AMPs может значительно варьироваться, что влияет на эффективность врожденного иммунитета.

Таким образом, целью данного исследования является всестороннее изучение экспрессии TLR2, TLR4, HBD-1, HBD-2, NF-kB и TNF-α в слизистых оболочках дыхательных путей новорожденных. Сравнительный анализ позволит выявить возможные нарушения в работе системы врожденного иммунитета у младенцев с инфекционно-воспалительными заболеваниями и респираторным дистресс-синдромом. Полученные результаты могут способствовать разработке новых стратегий профилактики и лечения данных состояний, а также улучшению исходов заболеваний у новорожденных.

С помощью биоинформатических подходов были идентифицированы характерные маркеры. Среди выявленных компонентов обнаружен сигнальный каскад, который, предположительно, поэтапно активируется при столкновении с патогеном: сначала рецепторная система, затем вторичные медиаторы и, наконец, эффекторные молекулы. В рамках данной работы было исследовано проявление генов TLR2 и TLR4, ответственных за распознавание наиболее распространённых бактерий, с которыми иммунитет младенца сталкивается на ранних этапах жизни. Оценена также активность гена транскрипционного фактора NF-kB, запускающего экспрессию врождённых иммунных эффекторных молекул. Эти процессы, в свою очередь, инициируют воспалительные реакции в ответ на проникновение возбудителя.

В исследование был также включён анализ других молекул: цитокина TNFα и антимикробных пептидов HBD-1 и HBD-2. TNFα является провоспалительным цитокином, участвующим в развитии воспаления при вторжении патогенных микроорганизмов. HBD-1 и HBD-2 — это антимикробные пептиды из семейства дефенсинов. При этом HBD-1 присутствует постоянно, и его уровень часто определяется генетическим профилем, тогда как HBD-2 — индуцируемый пептид, чья экспрессия активируется под действием специфических стимулов.

Широкое распространение внутриутробных и послеродовых инфекций, их тяжелое течение, сопровождающееся неспецифическими клиническими симптомами, создают серьезные трудности в диагностике. Идентификация возбудителей и интерпретация полученных данных осложняются, особенно учитывая появление микробных штаммов, устойчивых к антибиотикам. Летальность высокая, в случаях диагностики тяжелых форм внутриутробных и послеродовых инфекций среди новорожденных, подчеркивает острую необходимость в разработке и внедрении передовых методов микробиологической и иммунологической диагностики. Это также требует уточнения существующих диагностических критериев и совершенствования адекватной терапии для борьбы с инфекционно-воспалительными заболеваниями у новорожденных.

Цель исследования: установить видовой состав ключевых возбудителей инфекций нижних дыхательных путей. Оценить уровень экспрессии маркеров видового иммунитета у новорождённых, страдающих внутриутробными инфекциями и инфекционными поражениями дыхательных путей в раннем неонатальном периоде.

Исследования проводили на базе централизованной клинико-диагностической и бактериологической лаборатории «Республиканского центра инфекционных болезней» МЗ РД (РЦИБ), «Республиканской клинической больницы» МЗ РД (РКБ) г. Махачкала и на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГБОУ ВО «Дагестанский государственный медицинский университет» МЗ РФ. Клинический материал от новорожденных, полученный от 230 с ВУИ и 246 с РНП с симптомами инфекций респираторного тракта, находившихся на лечении в педиатрическом отделении родильного дома №3 Республиканской клинической больницы Министерства здравоохранения Республики Дагестан, послужил основой для данного исследования. Было проанализировано 936 образцов, из которых удалось выделить и идентифицировать до уровня рода или вида 587 штаммов микроорганизмов, согласно приказу № 464н от 18.05.21, регламентирующему проведение лабораторных исследований. Идентификация выделенных культур проводилась с использованием современных бактериологических анализаторов: Vitek 2 Compact (BioMerieux, Франция) для автоматизированного биохимического анализа и Vitek MS (BioMerieux, Франция) — метода времяпролетной масс-спектрометрии с применением матрично-ассоциированной лазерной десорбции/ионизации. Чувствительность всех идентифицированных микроорганизмов к антибактериальным препаратам определялась в соответствии с методическими указаниями МУК 4.2.1890-04.

Для количественной оценки иммунологических параметров, включая уровни интерлейкинов 4, 6 и фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α), использовалась сыворотка крови. Исследования проводились с применением иммуноферментной тест-системы («Вектор-БЕСТ») и автоматического анализатора «Лазурит» ("Dynex", США).

Анализ экспрессии генов врожденного иммунитета, а именно TLR2, TLR4, HBD-1, HBD-2, TNFα и NFkB, выполнялся на базе выделенной из клинического материала РНК. Для выделения РНК применялся набор «РИБОсорб» (ИЛС, РФ). Далее, с использованием набора «ОТ-1» (Синтол, РФ), проводилась обратная транскрипция. Приготовление реакционных смесей для полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществлялось с применением Hot Start Taq DNA Polymerase (Синтол, РФ). Амплификация проводилась в ПЦР-амплификаторе с функцией real-time ПЦР (ПЦР-РВ) модели ДТ96 (ДНК-технология, РФ). Уровень экспрессии генов оценивался относительно экспрессии референсного гена β-актина.

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью программного обеспечения StatTech v. 4.0.7, разработанного ООО «Статтех» (Россия).

В связи с количественным разнообразием наблюдений в исследуемых группах использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.

В группу наблюдения с диагнозом внутриутробная инфицированность плацентарного происхождения были включены 230 с ВУИ и 246 новорождённых с проявлениями ранней неонатальной инфекции дыхательных путей, наблюдавшихся в отделении реанимации новорождённых родильного дома №3 в период с 2023 по 2025 год.

Образцы крови, трахеобронхиального аспирата, мазка из зева и выделений из нижних дыхательных путей были направлены на микробиологическое исследование. У 213 из 230 обследованных (87,5%) бактериологические посевы продемонстрировали положительные результаты. Сравнение данных настоящего проспективного анализа с предыдущими ретроспективными исследованиями (2023–2024 гг.) показало высокую степень согласованности. Доминирующим возбудителем во всех случаях был Staphylococcus epidermidis — его частота составила 17,6% в текущем исследовании и 17,1% в предыдущих работах. Полученные данные приведены в таблице 1.

Сравнительный анализ таксономических групп УПМ показал значимые различия в разнообразии микрофлоры и уровнях её выявления в зависимости от исследуемых объектов. Изученный материал позволил выделить и определить до уровня вида 414 штаммов различных таксонов. Наибольшую концентрацию микроорганизмов продемонстрировал зев — 140 штаммов (33,8%), тогда как минимальную — кровь — 21 штамм (5,2%). Доля положительных бактериологических посевов составила 64,8%. Чаще всего у пациентов выявлялись заражения зева — 61,3%, трахеобронхиального отдела дыхательных путей — 59,3% и верхних дыхательных путей — 52,4% (p<0,05).

Поскольку основную долю изученных биоптатов составили урогенитальные патогенные микробы (УПМ), для оценки их этиологического значения проведён подсчёт изолятов из тканей биопсии, зева и внебрюшных дренажных путей. Под этиологически значимым считалась концентрация микроорганизмов, выделенная из тканей биопсии — не менее 10³ КОЕ/мл, из зева и внебрюшных дренажных путей — от 10⁴ КОЕ/мл.

Современные методологические рекомендации по лабораторной диагностике РНП предусматривают многоступенчатый подход из-за высокой степени сходства биохимических реакций и выраженной родственности представителей условно-патогенных энтеробактерий. Для улучшения точности и результативности проводимых исследований были внедрены опытные партии хромогенных питательных сред. Эти среды предназначены для одновременного выделения и установления видовой принадлежности патогенных энтеробактерий. В методику анализа мазков из области бронхов, пораженных туберкулезом, а также смывов из верхних дыхательных путей были включены специфические хромогенные среды: E. coli-колиформ-Proteus хром агар и Клебсиелла хром агар.

Данный подход позволяет оперативно дифференцировать и идентифицировать основные, клинически значимые условно-патогенные энтеробактерии, включая Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp. и Enterobacter spp., благодаря выявлению присущих им ферментативных активностей.

Исследовалась две группы пациентов: новорожденные с нозокомиальными пневмониями, затрагивающими респираторный тракт (РНП) (246 младенцев), и контрольная группа здоровых младенцев (103 ребенка). Выявлены различия в оказании интенсивной терапии. У детей с РНП наблюдалось статистически значимо более частое применение вазоактивных препаратов (p = 0,009) и повышенная потребность в экстренной реинтубации (p = 0,02) по сравнению с контрольной группой. Кроме того, младенцы с РНП требовали значительно более длительной искусственной вентиляции легких, как в условиях отделения интенсивной терапии, так и за все время пребывания в стационаре (p<0,001).

Источники инфицирования РНП дыхательных путей у новорожденных определялись с использованием стандартного бактериологического метода. Он включал установление этиологической структуры выделенных микроорганизмов и их количественную оценку с целью определения степени клинической значимости. Базовые данные были получены из результатов скрининговых обследований контрольных групп, а микрофлора исследовалась через 48–72 часа после рождения.

Значимой для этиологии заболевания считалась концентрация микробиоты от 104 КОЕ/мл для туберкулезных бронхиальных аспиратов (ТБА) и от 106 КОЕ/г для мазков с задней стенки глотки и верхних дыхательных путей.

У 246 обследованных новорожденных было выделено и идентифицировано 348 штаммов микроорганизмов в концентрациях, признанных этиологически значимыми. Этиологический состав РНП у исследованных младенцев приведен в таблице 2.

Согласно данным таблицы 2, наиболее распространёнными микроорганизмами являются K. pneumoniae — 19,7%, за ним следуют E. coli — 17,1%, S. epidermidis — 15,5% и P. aeruginosa — 11%. Анализ результатов выявил, что у 106 (43%) младенцев наблюдалась моноинфекциональная форма инфекции: у 31 (29,2%) — K. pneumoniae, у 24 (22,6%) — E. coli, у 19 (17,9%) — S. epidermidis, у 12 (11,3%) — P. aeruginosa, у 9 (8,4%) — Serratia marcescens, у 7 (6,6%) — Enterococcus faecalis, а у 4 (3,7%) — Enterobacter aerogenes и Citrobacter spp.

У 140 (57%) обследованных пациентов протекали смешанные инфекции, вызванные двумя и более возбудителями. Наиболее часто встречались случаи сочетания энтеробактерий с грамположительными кокками (18% случаев), с Pseudomonas (23%), а также двойные инфекции, спровоцированные грамположительными кокками и псевдомонадами (7%). Совместное инфицирование грамположительными кокками и иными грамотрицательными микроорганизмами отмечено у 2% новорожденных. Комбинированное поражение бактериями и грибковыми патогенами зафиксировано в 7% случаев.

Ультрафиолетовое излучение усиливает патогенное воздействие возбудителей за счет угнетения факторов местного иммунитета. Анализ биологических свойств выделенных штаммов микроорганизмов показал наличие у всех исследованных культур специфических факторов вирулентности.

Первым звеном иммунной защиты у человека служат Toll-подобные рецепторы (TLR) — компонент врождённой иммунной системы, способный распознавать консервативные структуры микробов, появляющиеся при повреждении клеточных мембран.

Сравнительный анализ экспрессии генов продемонстрировал, что в эпителиальных клетках верхних отделов дыхательной системы у здоровых новорождённых присутствует активность TLRs. У младенцев данной группы экспрессия гена TLR2 наблюдалась на уровне 149,7×10³ копий относительно актинового гена, а TLR4 — 0,8×10³ копий того же гена. Показатель TLR2 соответствовал значениям, типичным для детей других возрастных групп. Однако уровень TLR4 оказался статистически значимо выше на порядок. Это может объясняться отсутствием контакта с патогенами у новорожденных до рождения. С момента рождения интенсивность инфицирования значительно возрастает, что стимулирует усиление экспрессии рецепторов врожденного иммунитета.

В рамках исследования активности генов врожденного иммунитета в эпителии дыхательных путей у новорожденных с пневмонией были сформированы две группы: первая включала детей с воспалением верхних дыхательных путей (ВУИ), вторая — пациентов с острым поражением нижних дыхательных путей (РНП). В качестве контрольной группы были задействованы здоровые младенцы, не имеющие признаков инфекционных заболеваний или других патологий. Результаты исследования представлены в таблице 3.

В ходе исследования было установлено, что у младенцев с первичной устойчивостью к инфекционным заболеваниям (ВУИ) наблюдалось умеренное снижение экспрессии TLR2 и существенное подавление экспрессии гена TLR4, которое составило 2,24 кратное отклонение от нормы. При этом уровни дефенсинов находились в пределах физиологических значений. У пациентов с рецидивирующим аллергическим ринитом (РНП) были выявлены умеренные снижения экспрессии TLR2 (в 1,5 раза) и TLR4 (в 1,75 раза). У детей, страдающих пневмонией, отмечалась выраженная активация экспрессии провоспалительного цитокина TNFα и транскрипционного фактора NF-kB, что свидетельствовало о начале воспалительных реакций в эпителии дыхательных путей. Результаты корреляционного анализа представлены в Таблице 4.

Как видно, в группе здоровых новорождённых выявлена положительная ассоциация экспрессии TLR2 и HBD-1, TLR2 и HBD-2, HBD-1 и HBD-2 (при этом коэффициент составил 0,734, 0,734, 0,781, соответственно).

У новорождённых с воспалением верхних дыхательных путей выявлено схожее соотношение. У пациентов с поражениями нижних дыхательных путей взаимосвязь показателей имела иную природу — HBD-1 и HBD-2 коррелировали друг с другом (коэффициент корреляции составил 0,918). Кроме того, зафиксирована незначительная отрицательная зависимость между TLR4 и HBD-2.

Следовательно, в ходе бактериологического анализа S. epidermidis оказался преобладающим возбудителем воспалительных процессов в дыхательном тракте, что соответствует данным предыдущих ретроспективных исследований (2023–2024 гг.), где частота положительных результатов составила 17,6% и 17,1% соответственно. Спектр выявленной микрофлоры и уровень её обнаружения значительно варьировали в зависимости от анализируемого материала. Общее количество выделенных и определённых до вида штаммов — 414, представленных различными таксонами. Наибольшую степень колонизации продемонстрировал зев — 140 штаммов (33,8%) при сравнении с кровью, показавшей меньшую обсеменённость — 21 штамм (5,2%). Доля положительных культуральных посевов составила 64,8%.

Среди выявленных патогенов, вызывающих инфекции дыхательных путей, наиболее часто встречались K. pneumoniae — 19,7%, за ними следовали E. coli — 17,1%, S. epidermidis — 15,5% и P. aeruginosa — 11%. Полученные данные о микробиологическом статусе младенцев открывают перспективные направления для исследования взаимосвязи между типом микробной колонизации и состоянием системы врожденного иммунитета. Установлено, что преобладание моноинфекции или смешанной флоры может играть ключевую роль в модуляции иммунного ответа. В частности, детальное изучение комбинаций патогенов, выявленных у 140 младенцев, позволит выявить специфические триггеры, запускающие те или иные иммунные каскады.

Таким образом, в ходе бактериологического исследования выявлены лидирующие этиопатогены патологии дыхательной системы у новорожденных. Среди выявленных возбудителей, вызывающих инфекции дыхательных путей, наиболее часто встречались K. pneumoniae — 19,7%, за ними следовали E. coli — 17,1%, S. epidermidis — 15,5% и P. aeruginosa — 11%.

В работе установлено, что возбудители семейства Enterobacteriaceae в сочетании с грамположительными кокками (18%) и псевдомонадами (23%) представляет особый интерес, так как эти группы микроорганизмов часто ассоциируются с различными воспалительными реакциями. Особого внимания заслуживает микст инфекция грамположительными кокками и псевмонадами (7%), что может указывать на синергетический эффект патогенов, усугубляющий воспалительный процесс.

Также дана оценка экспрессии Toll-подобных рецепторов (TLR2) и антимикробных пептидов (HBD-1, HBD-2) в контексте выявленных микробных нагрузок является критически важным. TLR2, реагируя на компоненты клеточных стенок бактерий, запускает мощные сигнальные пути, ведущие к выработке цитокинов. HBD-1 и HBD-2, являясь ключевыми эффекторами врожденного иммунитета, обладают прямым антимикробным действием и могут влиять на дифференцировку и активацию иммунных клеток.

Анализ уровней TLR2, HBD-1 и HBD-2 в группах с различным микробным спектром позволит не только выявить их диагностическую значимость, но и прогнозировать тяжесть респираторных инфекций. Нарушения в экспрессии этих маркеров могут свидетельствовать о предрасположенности к более вялому или, наоборот, гиперактивному воспалительному ответу, что, в свою очередь, будет определять тактику ведения таких пациентов.

Современные трудности в диагностике воспалительных процессов у новорождённых обусловливают необходимость одновременного определения возбудителя инфекции и оценки активности маркеров врождённой иммунной системы, что позволяет раскрыть причины формирования патологии в раннем возрасте и обеспечить целенаправленное назначение этиотропной терапии с учётом физиологических особенностей неонатального периода.

В действующих протоколах недостаточно учитываются современные подходы к выявлению микробных агентов и мониторингу сопутствующих осложнений, при этом стандартные лабораторные алгоритмы часто не обеспечивают полноты данных, что способствует получению ложноотрицательных результатов. Большинство научных работ свидетельствуют о высокой эффективности иммуно- и генетических методов в выявлении групп риска среди новорождённых, требующих комплексного обследования, что существенно повышает вероятность раннего и точного выявления патологии.