A METHODOLOGY FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF FLAVONOID AMOUNT IN STEVIA REBAUDIANA RAW MATERIAL

В медицинской практике многих стран сырье стевии Ребо (Stevia rebaudiana Bertoni, сем. Астровые – Asteraceae) применяется в качестве антидиабетического средства. По литературным данным продукты на основе растения стевия Ребо обладают гипотензивным, адаптогенным, гипогликемическим, антимикробным, антиоксидантным действиями [1], [5], [15], [16].

Актуальной проблемой является выработка эффективных стандартов относительно лекарственного сырья из стевии Ребо для нужд фармацевтической промышленности. В листовых пластинках стевии содержатся дитерпеновые гликозиды, флавоноиды, фенилпропаноиды, сапонины [2], [4], [6], [11]. Однако химический состав разновидностей стевии недостаточно изучен. В процессе практического выявления, в том числе количественным способом, флавоноидов в растительном сырье принято использовать те или иные методики спектрофотометрии [7], [10], [12], [14]. Данные методы отличаются простотой, быстротой и удобством, отсутствует необходимость использования дорогостоящей техники.

Субстратом для исследовательской работы послужили подвергнутые сушке листовые пластинки стевии Ребо (Stevia rebaudiana Bertoni). Происхождение сырья – Пензенская, Тверская области, Краснодарский край, Республика Крым, а также импорт из Парагвая и Индии.

С целью установления факта наличия флавоноидов в исследуемых образцах применялся метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) [7], [8], [9], [10]. На линию старта хроматографической пластинки, которая была приведена в активное состояние в сушильном шкафу при температуре 100-105 оС, с помощью пипетки было нанесено 0,02 мкл водно-спиртового экстракта из листовых пластинок стевии Ребо. При этом веществами-свидетелями выступали спиртовые растворы стандартных образцов (СО) цинарозида, лютеолина, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, рутина, гиперозида, кверцетина. В дальнейшем хроматографическую пластинку располагали в камеру для хроматографии. В последней была создана атмосфера с высоким содержанием испаренных растворителей. Выдержка составляла 1 сутки. Собственно процесс тонкослойной хроматографии производился восходящим методом по формуле хлороформ – этиловый спирт 70 % – вода (26:16:3) на стандартных хроматографических пластинках «Сорбфил-ПТСХ-АФ-Ф-УФ». После того как фронт растворителя проходил около 8 см, используемую пластинку извлекали из рабочей камеры, высушивали и детектировали зоны веществ. Получившиеся хроматограммы изучались в условиях естественного освещения, в ультрафиолетовом спектре при длинах волн равных 366 и 254 нм, проводилась спектрофотометрия. Кроме этого, полученные хроматограммы подвергались воздействию щелочного раствора ДСК и фосфорно-молибденовой кислоты.

Содержание суммы флавоноидов оценивали методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на цинарозид [8], [9]. Для измерений на спектрофотометре СФ-200 использовали кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Спектры собственного поглощения флавоноидов листьев стевии регистрировали в интервале длин волн 200 - 500 нм. Для количественного определения флавоноидов в извлечениях из листьев стевии применяли метод дифференциальной спектрофотометрии. Статистическую обработку осуществляли по методике, описанной в ГФ XIII. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в процентах (Х) вычисляли по формуле:

где:

A –оптическая плотность раствора;

350 –удельный показатель поглощения цинарозида с алюминия хлоридом при длине волны 400 нм;

а –  навеска сырья, г;

W –влажность сырья, %.

Итогом проведенного анализа с использованием метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) стал факт доминирования в листовых пластинках стевии Ребо такого флавоноида как цинарозид. На полученной в результате исследования хроматограмме заметно, что присутствует ярко выраженная область оранжевого оттенка Rf (фактор удерживания) в районе 0,55 на уровне стандартного образца хлорогеновой кислоты. Также на полученной хроматограмме видна область желтого оттенка с Rf (фактор удерживания) в районе 0,64 на уровне стандартного образца цинарозида (рис.2). Следовательно, наиболее практичным способом осуществления качественного исследования листовых пластинок стевии Ребо и веществ на их основе методом ТСХ является применение вещества-стандарта цинарозида с целью подсчета величин Rf.

В соответствии с данными литературы, можно сказать, что цинарозид характерен для сырья многих представителей семейства сложноцветные (пижма, одуванчик, расторопша др.) [8], [9].

Рисунок 1 - Схема хроматограммы извлечения из стевии листьев. Система хлороформ – этиловый спирт 70 % – вода (26:16:3):

1 – извлечение из стевии листьев (1:50); 2- СО цинарозида, 3 - СО лютеолина; 4 - СО кофейной кислоты; 5 - СО хлорогеновой кислоты; 6 - СО рутина; 7 - СО гиперозида; 8 - СО кверцетина

DOI:10.23670/IRJ.2022.126.11.1

Выбор оптимального  экстрагента и параметров экстракции имеют непосредственное влияние на выход действующих веществ. Результаты исследования влияния экстрагента на процесс экстракции представлены в табл. 1.

При исследовании влияния, различных параметров экстракции на выход действующих веществ, нами были получены следующие результаты (таб. 2). 

С целью разработки проекта методики количественного определения суммы флавоноидов определены оптимальные условия экстракции:

экстрагент – спирт этиловый 70%;

соотношение «сырье – экстрагент» - 1:100;

время экстракции – 45 минут;

степень измельченности сырья – 2 мм.

Следует отметить, что, по нашим данным, степень измельчения от 1 до 3 мм сильного влияния на экстракцию не оказывает. В качестве оптимальной нами выбрана степень измельчения 2 мм.

Количественное определение содержания флавоноидов основано на химической реакции комплексообразования с хлоридом алюминия [5], [6], [7] ,[8]. В процессе данной реакции происходит батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов. Последний успешно детектируется в ультрафиолетовом спектре как максимальное значение поглощения на длинах волн от 380 до 412 нм [5], [7], [8]. Проведенное практическое исследование позволило выявить, что в присутствии хлорида алюминия максимальное значение поглощения продукта реакции комплексообразования с участием флавоноидов стевии приходится на длину волны 400±2 нм.

Рисунок 2 - УФ спектр водно-спиртового извлечения стевии листьев:

1 – исходный раствор (1:5000); 2 – раствор в присутствии AlCl3

DOI:10.23670/IRJ.2022.126.11.4

Рисунок 4 - Электронные спектры раствора цинарозида в присутствии AlCl3

DOI:10.23670/IRJ.2022.126.11.5

Рисунок 5 - УФ-спектр извлечения из стевии листьев (1:1250) в присутствии AlCl3

DOI:10.23670/IRJ.2022.126.11.6

В результате использования различных концентраций этанола положение максимумов не меняется. В результате комплексообразования флавоноидов стевии с хлоридом алюминия образуется комплексное соединение с максимумом поглощения 400 нм.

В нашей работе в качестве стандарта был использован цинарозид, который с хлоридом алюминия имеет максимум при 400 ±2 нм (рис. 3) и также используется в методиках анализа сырья, содержащего флавоноиды [7], [9], [10], [14]. Следовательно, извлечение из листьев стевии и цинарозид по спектральным характеристикам близки, и цинарозид может быть использован в методике количественного определения в качестве стандарта.

Максимальное количество флавоноидов из листьев стевии в оптимальных условиях составило 1,74% весовых, что позволяет поставить это растение по содержанию флавоноидов в один ряд с уже используемыми лекарственными растениями – источниками флавоноидов (табл.3).

Для того чтобы предлагаемая методика заняла достойное место при определении качества листьев стевии, были определены метрологические характеристики, ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет не более ± 1,39 % (табл.3). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки используемой нами методики.

Установлены оптимальные условия методики экстракции стевии листьев:

- экстрагент – 70% спирт этиловый;

- соотношение «сырье и экстрагент» – 1: 100;

- степень измельченности сырья – 2 мм;

- время экстракции – 45 мин.

Определено, что в листьях стевии содержится до 1,74% суммы флавоноидов. 

Полученные результаты доказывают, что листья стевии являются перспективным лекарственным растением, и являются ценным источником флавоноидов. Целесообразно дальнейшее изучение для разработки нормативных документов.