The application of stromal vascular fraction in periodontology
The application of stromal vascular fraction in periodontology
Abstract
Currently, the search for new methods of treating periodontitis remains relevant due to the widespread incidence of the disease. In this article, we will discuss a new method of treating chronic periodontitis using stromal vascular fraction.
Treatment for chronic periodontitis was carried out on 65 people aged between 38 and 66. Patients were divided into two groups depending on the type of treatment: in group I, the main group of 33 people with moderate chronic periodontitis, in addition to standard treatment, stromal vascular fraction (SVF) injections were administered into periodontal pockets; and in group II — the control group of 32 people with moderate chronic periodontitis, who received only basic treatment. All patients underwent a dental examination and a periodontal chart was drawn up, including the following indicators: periodontal pocket depth, pathological tooth mobility, bone resorption, Muhllemann bleeding index and hygiene index, and the state of microcirculation in the periodontal tissues.
After a course of injections with the stromal vascular fraction, all indicators improved in the main group, namely, the depth of periodontal pockets decreased by 1,4 mm, bone resorption decreased by 25,5%, tooth mobility decreased by one degree, blood flow perfusion increased, reaching a normal level of 30,02±4,36 perf. units, and index values also improved.
Thus, it can be concluded that we achieved sustained remission, restoration of periodontal attachment and bone mineralisation levels in the interdental septa of the alveolar bones using stromal vascular fraction injections.
1. Введение
Пародонтит является одной из главных причин потери зубов, что приводит к таким последствиям, как нарушение жевательной функции, изменения прикуса, атрофии костной челюстной ткани . Помимо важных физиологических последствий, немаловажны и эстетические: нарушение речи, изменение внешнего вида, на фоне данных изменений снижается уверенность в себе, таким образом возникают и психологические проблемы. Вышеперечисленные последствия: физиологические, эстетические, психологические, приводят к снижению уровня жизни .
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) считает заболевания пародонта пандемией, распространённость которой вызывает тревогу в разных возрастных группах и географических регионах. Заболеваниями пародонта страдают около 19% взрослого населения планеты, что составляет более миллиарда случаев. В том же отчёте по европейским странам указано, что более 50% населения Европы могут страдать от той или иной формы пародонтита, при этом более 10% страдают от его тяжёлой формы, а среди населения в возрасте 60–65 лет этот показатель возрастает до 70–85% .
Таким образом, несмотря на разнообразие имеющихся протоколов и методов лечения хронического пародонтита, результаты имеют кратковременный эффект. Исходя из этого, поиск новых алгоритмов и методов лечения, создание усовершенствованных медикаментозных средств, содержащих в своем составе ингредиенты, обладающие необходимыми свойствами для стабилизации процесса и удлинения сроков ремиссии при хроническом пародонтите, является актуальным.
В последние годы в различных отраслях медицины широко используется метод терапии стромально-васкулярной фракцией. Методика проведения СВФ в травматолгии: Липоаспират интенсивно отмывали холодным поддерживающим раствором, забуференными фосфатами (ЗФР; «Биолот», Россия), после чего урлиферментативной диссоциации с помощью 0,1% раствора коллагеназы 1А типа (Sigma-Aldrich, США) в течение 45 минут при 37 °С и периодическом встряхивании. По окончании инкубации проводят инактивацию фермента и двукратную отмывку клеточной суспензии с помощью дополнительного раствора. Нерасщепленные фрагменты упругой ткани удаляли фильтрованием через нейлоновые фильтры (размером 100 цт). Полученные таким образом радиоактивносодержащие так называемой стромально-васкулярной группы клеток (СВФ) ресуспендировали в последовательном растворении, подсчитывали количество и обеспечивали целостность (по исключению трипанового синего; Sigma-Aldrich, США). Клетки СВФ вводили однократно интраартикулярно под УЗИ-навигацией в глубину 3 мл клеточной взвеси на сустав
. В гинекологии: у женщин с гистологически верифицированным диагнозом САЛВ в асептических условиях под местной анестезией производится забор жировой ткани путем аспирационной липосакции в нижней трети передней брюшной стенки в условиях операционной. Объем аспирируемой жировой ткани составлял от 150 до 250 мл (средний объем — 170,6±31,2 мл). В стерильных условиях осуществлялось ферментативная обработка, промывание и фильтрация липоаспирата с последующим центрифугированием и получением стромально-васкулярной фракции жировой ткани. Осуществлялась оценка качества аутологичных регенеративных клеток (стромально-васкулярной фракции) жировой ткани: подсчет количества клеток с помощью автоматического счетчика клеток Counters Invitrogen (Invitrogen), определение иммунологической принадлежности и жизнеспособности методом проточной цитофлюориметрии (BD FACS Canto II, USA). Для исследования фенотипа клеток стромально-васкулярной фракции использовались моноклональные антитела к следующим антигенным маркерам: CD146, CD31, CD45, CD34, CD105, CD146 (BD Bioscience, USA). Окрашивание проводили в соответствии с рекомендациями производителя. После получения результатов лабораторной оценки проводили внутрикожное введение жизнеспособных клеток стромально-васкулярной фракции жировой ткани путем инъекций по всей поверхности пораженной области в области больших и малых половых губ (очаги атрофии слизистой промежности) в объеме 2 мл . В нейхирургии при повреждении плечевого сплетения: при липосакции с предварительным обезболиванием 0,25% раствором лидокаина использовались канюли 4 мм. В условиях специализированной лаборатории, после проведенной липоаспирации получали СВФ-ЖТ. В среднем из 150–200 мл жира мы получали 7,5–8 млн клеток СВФ-ЖТ. Далее выполнялось оперативное вмешательство на стволах плечевого сплетения. При микрохирургическом наружном и внутреннем невролизе, эндо-невролизе стволов плечевого сплетения введение СВФ-ЖТ осуществлялось в зону с наиболее выраженным очагом фиброзного поражения . В области стоматологии способ лечения хронического генерализованного пародонтита апробирован на экспериментальной модели хронического пародонтита и заключается в инъекционном введении в мягкие ткани пародонта стромально-васкулярной фракции (СВФ), полученной из аутологичной жировой ткани на 4 сутки после операции лазерного кюретажа. Моделирование хронического пародонтита на кроликах породы Советская Шиншилла проводили в соответствии с авторской методикой (Патент РФ №2654598, 2018). Жировую ткань забирали интраоперационно из брызжейки. Выделение стромально-васкулярной фракции проводили неферментным методом. Общий объем полученной в ходе операции жировой ткани от одного животного достигал 20 мл. Далее производили центрифугирование шприцов с липоаспиратом в течение 4 минут при скорости 2500 оборотов/мин, без остановки. После центрифугирования жировую фракцию извлекали с помощью верхнего шприца АСР. Заготовленный центрифугированный жир медленно переносили в один из 10 мл шприцов через коннектор 2.4 мм. Затем эту порцию жира интенсивно «перегоняли» 30 раз с максимальной скоростью между двумя 10 мл шприцами через коннектор 1,4 мм. Далее вновь переносили данную эмульгированную жировую фракцию в шприцы АСР и производили повторное центрифугирование в течение 4 мин при 2500 оборотах/минуту. После повторного центрифугирования на дне шприцов выявлялся клеточный осадок (стромально-васкулярная фракция) в объеме 5 мл. Введение стромально-васкулярной фракции проводили на 4 сутки после операции лазерный кюретаж. СВФ вводили с помощью иглы G30 в маргинальную десну экспериментального животного в 10 точках из расчета 0,5 мл/точка .Основанная на выделении из жировой ткани стромально-васкулярная фракция (СВФ) представляет собой гетерогенную клеточную популяцию эндотелиоцитов, эритроцитов, фибробластов, клеток гладкой мускулатуры, перицитов, макрофагов и мезенхимальных стволовых клеток, которые имеют пластически-адгезивный характер. Мезенхимальные стволовые клетки обеспечивают противовоспалительное, иммуномодулирующее и антиапоптотическое действие, а также стимулируют ангиогенез, рост и дифференцировку тканей в месте повреждения. Поэтому СВФ имеет огромный потенциал для терапевтического применения при заболеваниях, сопровождающихся локальным повреждением мягких тканей и развитием воспалительного процесса . Пародонтит является воспалительным заболеванием, а при местном применении СВФ оказывает противовоспалительное, иммуномодулирующее и антиапоптотическое действие, а также стимулируют ангиогенез, рост и дифференцировку тканей в месте повреждения, обладает фагоцитарной, буферной трофической, гемостатической, защитной способностью, поэтому использование СВФ в пародонтологии значительно сократит сроки лечения и достигнется стойкая ремиссия.
2. Методы и принципы исследования
Проведено лечение хронического пародонтита (ХП) (К 05.3) у 65 человек от 38 до 66 лет. Критериями включения являлись лица с индексом массы тела более 30, старше 35 лет, любого пола. Критериями исключения: беременность, хронические заболевания, индекс массы тела менее 30, новообразования, сахарный диабет, гипертония. Рандомно пациенты были разделены на 2 группы в зависимости от вида лечения:
I — основная группа (ОГ) 33 пациента с ХП, которым к дополнению стандартного лечения проводили инъецирование стромально-васкулярной фракции (СВФ) в ткани пародонта;
II — контрольная группа (КГ) 32 пациента с ХП, которым применяли базовую терапию лечения.
Всем пациентам до начала лечения было проведено стоматологическое обследование, диагностика: сбор анамнеза; заполнение медицинской документации; осмотр полости рта (десна гиперемирована, в патологический процесс вовлечены ткани пародонта нижней челюсти, отмечается неприятный запах изо рта, мягкие и твердые зубные отложения, отечность маргинальной десны); индекс кровоточивости Мюллемана — при зондировании с помощью пародонтологического пуговчатого зонда, у ОГ и КГ индекс составил 3,5±0,3 р<0,001, и индекс Грина-Вермиллиона (ИГР-у) — оценка количества зубного налета и зубного камня, то есть состояние уровня гигиены полости рта, окрашивая 6 зубов, ОГ составил 3,3±0,3 р<0,001, КГ 3,5±0,3 р<0,001, что говорит о неудовлетворительной гигиене полости рта; на снимке КЛКТ, обнаружено расширение периодонтальной щели, резорбция костных стенок альвеол на ½, разрушение кортикальной пластинки; пародонтальным зондом зарегистрировали глубину карманов 5,1мм,и при помощи пинцета патологическую подвижность зубов 2 степени; «Важным звеном патогенеза, сопровождающим все стадии ХП, являются нарушения микрососудистого русла, которые обуславливают клинические проявления данного заболевания» , состояние микроциркуляции тканей пародонта оценивали на лазерном анализаторе капиллярного кровотока ЛАКК-0П» (НПП «ЛАЗМА», Россия) , излучение лазера доставляется к тканям десны, где оно воздействует на ткань с разной частотой. Отраженный сигнал поступает в программу, где проводится регистрация данных и расчет микрогемодинамических значений. Исследование проводится на разных частях десны и позволяет получить точные данные, диагностика осуществлялась путем зондирования тканей пародонта лазерным лучом на глубину до 1 мм3 с диаметром датчика 3 мм., где объем перфузии кровотока составлял 21,09±0,08 р=0,004 перф.ед.(ОГ), 20,07±0,08 (КГ), а скорость кровотока, у ОГ и КГ 2,15±0,09 р<0,001 перф.ед.
65 пациентам была проведена санация полости рта, проведение базовой терапии, путем профессиональной гигиены (путем снятия наддесневых и поддесневых зубных отложений, с помощью ультразвука, Аэрофлоу, кюретами Gracey удаляли поддесневые зубные отложения, сглаживая поверхность зубных корней, обработка пародонтальных карманов, антисептическое полоскание полости рта антисептиком «Мирамистин», нанесение повязки на десну геля «Метрогил дента» 2 раза в день).
Основной группе после базовой терапии было проведенено следующее лечение. По методике тумесцентной липоаспирации проводят забор жировой ткани. Под местной анестезией делают микроразрез на передней брюшной стенке, вводят раствор (анестетик + солевой состав + адреналин), под его действием жировые клетки становятся выраженными для их забора, с использованием канюли для липосакции, диаметром 4 мм, длиной 300 мм, с одним центральным отверстием и двумя боковыми и коннектором для шприца на 60 мл. Возвратно-поступательными движениями выполняют забор жировой ткани в объеме 150 мл. Для выделения стромально-васкулярной фракции из жировой ткани используют специализированные двойные шприцы Arthrex АСР®, объемом 15 мл. После получения достаточного объема жировой ткани шприцы Arthrex АСР® в количестве 4 штук, заполненные жировой тканью, помещаются в настольную центрифугу Rotofix 32 А с роторами-крестовинами, свободно подвешенными стаканами. Проводят центрифугирование при режиме 2500 оборотов/минуту на протяжении 4 минут. После однократного центрифугирования удаляют тумесцентную жидкость и выполняют перенос жировой ткани в шприц Luer-Lock 10 мл. Далее с использованием коннектора диаметром 1,4 мм и двух шприцов Luer-Lock 10 мл проводят последовательный перенос оставшейся жировой ткани из шприца в шприц через коннектор в количестве 30 раз с целью механической обработки. После чего обработанную ткань переносят в шприцы Arthrex АСР для повторного центрифугирования при режиме 2500 оборотов/минуту на протяжении 4 минут. За счет центробежной силы происходит разделение жировой ткани на компоненты, получается чистая стромально-васкулярная фракция, состоящая из мезенхимальных стволовых клеток, преадипоцитов, гладкомышечных клеток, эндотелиальных клеток, перицитов, T-клетки, макрофагов. Заключительный этап заключается в переносе стромально-васкулярной фракции с использованием коннектора диаметром 1,4 мм в шприц Luer-Lock объемом 3 мл. Затем стромально-васкулярную фракцию инъецируют в ткани пародонта в области пародонтального кармана в 2 точках по 1мл. Инъекции СВФ проводят с помощью шприца диаметром иглы 27—31G, общее количество введенных клеток от 15 до 25 млн. Курс лечения 3 процедуры с интервалом 5 дней.
При местном применении СВФ оказывает противовоспалительное, иммуномодулирующее и антиапоптотическое действие, а также стимулируют ангиогенез, рост и дифференцировку тканей в месте повреждения, обладает фагоцитарной, буферной трофической, гемостатической, защитной способностью. За счет центробежной силы происходит разделение жировой ткани на компоненты, получается чистая стромально-васкулярная фракция, состоящая из мезенхимальных стволовых клеток, преадипоцитов, гладкомышечных клеток, эндотелиальных клеток, перицитов, T-клеток, макрофагов.
3. Основные результаты
Улучшение показателей основной группы: резорбция костной ткани уменьшилась за 3 на 25,5%, пародонтальный карман на 1,4 мм, подвижность на 1 степень (рис. 1).
Рисунок 1 - Динамика показателей
Отмечается значимое снижение индекса кровоточивости — на 42,9% (р<0,05), при аналогичном сдвиге у пациентов контрольной группы — на 20% (р<0,05). Курсовое применение лечебных мероприятий у пациентов ОГ группы привело к снижению гигиенического индекса на 40,0% (р<0,05), при уменьшении параметра у пациентов контрольной группы на фоне базовой терапии –на 15,0% (р<0,05) в сравнении с первоначальными значениями (рис. 2).
Рисунок 2 - Динамика индексов
На фоне лечебной терапии с применением СВФ у основной группы наблюдается возрастание объема перфузии кровотока — достигающие нормы 30,02±4,36 перф.ед. Для контрольной группы, несмотря на повышение показателя, он все равно ниже нормы 23,02±0,34 перф.ед. (р <0,001). Кроме того, значимы различия при р <0,001 в скорости перфузии кровотока после лечения в основной группе, что доказывает эффективность предложенного лечения по сравнению с традиционным подходом (рис. 3).
Рисунок 3 - Динамика гемодинамических показателей
4. Заключение
Предложенным методом лечения с инъецированием в ткани пародонта, а именно в область пародонтальных карманов, СВФ, мы добились стойкой ремиссии, восстановление зубодесневого пародонтального прикрепления и уровня минерализации костной ткани межзубных перегородок альвеолярных костей, нормализации микрогемодинамики в тканях пародонта, что подтверждает эффективность данного метода, и необходимости его внедрения в клиническую стоматологию.