Modelling of nutrient medium for maximum biomass accumulation of yeasts of the genus Rhodotorula
Modelling of nutrient medium for maximum biomass accumulation of yeasts of the genus Rhodotorula
Abstract
Fodder production in Russia is actively developing and shifting to an import-substitution policy. Therefore, many enterprises need high-quality raw materials for the production of compound fodders and premixes for fish farms. One of the key components of fodder is carotenoids, which improve fish health and organoleptic indicators of fishery products. Yeasts are efficient carotenoid producers, which contain a lot of protein and are able to accumulate biologically active substances in the process of metabolism. Carotinogenesis of yeast cell is greatly influenced by the chemical composition of nutrient medium and cultivation conditions. By modelling the nutrient medium and creating certain conditions during cultivation, it is possible to achieve maximum accumulation of biomass and target product by yeast.
1. Введение
Кормопроизводство в Российской Федерации последние пять лет активно развивается и переходит от импорта кормов для рыб к отечественному производству , . Комбикорма и премиксы, используемые в рыбных хозяйствах, должны иметь определенный состав, чтобы популяция животных росла и развивалась без болезней и патологий. Состав кормов оказывает существенное влияние на здоровье рыб – при потреблении недостаточного количества микро и макроэлементов, витаминов и минералов, страдает репродуктивная система животных, ухудшаются качества получаемого мяса и икры . Основой кормов для рыб служат легкоусвояемые белки, которые необходимы для развития мышечной ткани, также корма должны содержать липиды и витамины, необходимые для здорового метаболизма.
В качестве белковой составляющей многие производители используют рыбную муку, полученную путем переработки отходов рыбного производства. Протеин из данного сырья не всегда отвечает требованиям по безопасности кормов и премиксов, так как для производства рыбной муки используются промысловые мелкие морские рыбы, в организме которых часто встречаются различные токсины . В связи с этим у производителей кормов возникает потребность в источнике белков, который будет соответствовать предъявляемым требованиям. Дрожжи являются перспективным источником белка за счет их быстрой скорости роста и накопления биомассы. Клетка дрожжей содержит до 50% (в сухом веществе) протеинов, состоящих из незаменимых аминокислот, которые лучше и успешнее усваиваются рыбами, чем рыбная мука или растительный белок . Дрожжевые базидиомицеты растут на простых питательных средах и не требуют особых условий культивирования. Некоторые представители микроскопических грибов также способны продуцировать биологически активные вещества – каротиноиды, витамины.
Каротиноиды – пигменты от оранжевого до красного цвета, синтезируемые многими высшими растениями, водорослями и микроскопическими грибами. Соединения, которые относятся к группе каротиноидов (β-каротин, ликопин, астаксантин, зеаксантин и др.) можно добавлять в корма, и они положительно влияют на насыщенность окраски мышечной ткани рыб и цвет икры . Антиоксидантные свойства каротиноидов благоприятно влияют на здоровье рыб, предотвращая развитие рака и других заболеваний. Они также увеличивают стрессоустойчивость рыб и их сопротивление негативным факторам окружающей среды. При добавлении каротиноидов в состав комбикормов было также замечено их влияние на сроки хранения продукции. Каротиноиды препятствуют окислению липидов в процессе хранения и прогорканию сухих веществ, что также выгодно для рыбных хозяйств, которые закупают большие объемы и долго их хранят .
Среди всех продуцентов каротиноидов больше преимуществ имеют красные дрожжи. Род дрожжей Rhodotorula показывает высокую эффективность, и они способны синтезировать большое количество каротиноидов в процессе метаболизма. Микроводоросли уступают дрожжам, так как при их выращивании требуется строгое соблюдения условий культивирования, чтобы не было заражения простейшими, и более сложный состав питательной среды. Клетки микроводорослей также очень плотные, что препятствует извлечению каротиноидов и делает процесс очистки более трудоемким и требующим дополнительных затрат . Биомасса дрожжей эффективно выращивается на отходах пищевой промышленности и устойчива к изменениям окружающей среды, что делает ее технологичным продуцентом. Изменяя условия культивирования дрожжей, можно добиться продуцирования каротиноидов определенного химического состава. С помощью облучения биомассы разными длинами волн света наблюдается изменение количественного выхода каротиноидов .
Питательная среда для выращивания дрожжей оказывает существенное влияние на количество продуцируемых каротиноидов и их качественный состав. В зависимости от физико-химического состава субстрата, накопление каротиноидов в одном штамме различно. Моделирование питательной среды с помощью обогатителей или составление собственной рецептуры позволяет контролировать синтез каротиноидов и добиться максимального выхода целевого продукта .
Цель данного исследования – исследование влияния состава питательной среды на накопление биомассы дрожжами рода Rhodotorula.
2. Условия, материалы и методы проведения исследований
Для проведения исследований нами были выбраны штаммы Rhodotorula rubra и Rhodotorula roseum. Пробирки с музейными культурами дрожжей Rhodotorula получены из Всероссийской коллекции культур сельскохозяйственного назначения ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии».
На начальном этапе исследования оба вида дрожжей выращивали на универсальной плотной питательной среде ГМФ-агар в чашках Петри при 28–30 °C. Выращенные колонии дрожжей были насыщенного оранжевого цвета, что свидетельствовало о наличии большого количества пигментов.
На следующем этапе исследования необходимо было накопить биомассу, поэтому дальнейшее культивирование дрожжей проводили на жидких питательных средах в лабораторных ферментерах в лаборатории микробиологии высшей школы биотехнологии и пищевых производств СПбПУ.
Анализ литературных источников показал, что для выращивания дрожжей больше всего подходят питательные среды, содержащие легкоусвояемые источники углеводных и азотистых питательных веществ и минеральные соли, поэтому в качестве основы для модельных сред были взяты углеводы. Картофельный отвар в одном варианте среды был выбран в качестве дешевого и легкодоступного источника полисахарида крахмала. Контролем служила универсальная питательная среда ГМФ, на которой хорошо растут все микроорганизмы.
После анализа литературных источников были выбраны три варианта питательных сред для культивирования каротиноидных дрожжей:
Вариант 1 – универсальная питательная среда ГМФ (см. табл. 1).
Таблица 1 - Состав питательной среды (вариант 1)
Компонент среды | Концентрация компонента (г/л) |
ГМФ–основа | 15,0 |
Натрия хлорид | 9,0 |
Вариант 2 – питательная среда на основе картофельного отвара (см. табл. 2).
Таблица 2 - Состав питательной среды (вариант 2)
Компонент среды | Концентрация компонента |
Картофельный отвар | 1 л |
Глюкоза | 20 г/л |
Для приготовления питательной среды брали 300 г картофеля и варили в 1 литре воды до готовности, после чего брали готовый картофельный концентрат и доводили дистиллированной водой до 1 л. Затем в картофельный отвар добавляли 20 г/л глюкозы микробиологического и стерилизовали среду в течение 20 мин при температуре 125 °C.
Вариант 3 – полусинтетическая питательная среда на основе маннита, дрожжевого экстракта и солей (см. табл. 3).
Таблица 3 - Состав питательной среды (вариант 3)
Компонент среды | Концентрация компонента (г/л) |
Маннит | 10,0 |
Дрожжевой экстракт | 1,0 |
K2HPO4 | 0,5 |
MgSO4*7H2O | 0,2 |
NaCl | 0,1 |
При проведении исследований выращивание дрожжей проводили в лабораторных условиях в ферментерах объемом 0,5 л. В каждый вариант с питательной средой вносилась чистая культура дрожжей Rhodotorula rubra и Rhodotorula roseum в стерильных условиях.
По окончании процесса культивирования на жидких питательных средах определяли титр выращенных микроорганизмов и суммарное количество каротиноидов.
Суммарное содержание каротиноидов определяли спектрофотометрическим методом в кювете, имеющей толщину слоя 1 см, длина волны 450 нм. В качестве раствора сравнения использовали этиловый спирт.
Расчет количественного суммарного содержания каротиноидов в мкг/г (Х) (в пересчете на β-каротин), проводили по формуле:
,
где:
D – оптическая плотность раствора испытуемого образца;
а – навеска в граммах;
100 – разведение в миллилитрах;
2500 – Е экстинкция (показатель поглощения удельный β-каротина в спирте при длине волны 450 нм);
10 – содержание β-каротина в 1 мл 1 % раствора в спирте в миллиграммах.
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Результаты посевов культуры Rhodotorula rubra
Титр дрожжей Rhodotorula rubra на трех вариантах сред представлен на рисунке 1.
Рисунок 1 - Титр культуры Rhodotorula rubra к моменту окончания процесса культивирования 1, 2, 3
3.2. Результаты посевов культуры Rhodotorula roseum
Титр дрожжей Rhodotorula roseum на трех вариантах сред представлен на рисунке 2.
Рисунок 2 - Титр культуры Rhodotorula roseum к моменту окончания процесса культивирования 1, 2, 3
Общее количество каротиноидов (в пересчете на β-каротин), продуцируемых дрожжами Rhodotorula rubra получилось 1792,73 ±0,05 мкг/г, а этот же показатель у дрожжей Rhodotorula roseum получился 1340,00 ±0,05 мкг/г.
4. Заключение
По результатам проведенных исследований показано, что наилучшей питательной средой для выращивания дрожжей Rhodotorula rubra и Rhodotorula roseum является полусинтетическая питательная среда на основе маннита, дрожжевого экстракта и минеральных солей (вариант 3). Наибольшее суммарное содержание каротиноидов было получено из штамма Rhodotorula rubra. Таким образом, данный штамм наиболее технологичен и более коммерчески эффективен.