Integrated research of ultrasound and enzyme treatment in extraction of phenolic compounds from cauliflower leaves (Brassica oleracea L. var. botrytis)
Integrated research of ultrasound and enzyme treatment in extraction of phenolic compounds from cauliflower leaves (Brassica oleracea L. var. botrytis)
Abstract
The article analyses the resource potential of waste of plant origin in terms of processing and possible beneficial use with the production of valuable biologically active substances within the framework of bioeconomy. The object of the study is cauliflower leaves (Brassica oleracea L. var. botrytis) grown in the North-West region of Russia. The aim of the research was a comprehensive study of the efficiency of the combined method of ultrasonic and enzymatic treatment in the extraction of phenolic compounds from cauliflower leaves. Extraction was carried out by the traditional method of maceration and combined method of ultrasonic processing using ultrasonic bath GRAD 40-35 and domestic enzyme preparations «Cellulase» and «Pectinase». The content of phenolic compounds was determined by spectrophotometric method on spectrophotometer PE-5400UV. The rational dose of enzyme preparations application in the amount of 3% of raw material weight and the ratio of pectinase to cellulase 1:3 were determined. The rational conditions of extraction of phenolic compounds in terms of gallic acid were determined: hydromodule — 20 ml/g; extraction duration — 60 min; ultrasound power — 49.5 W (2.36 W/g). The results of the study confirm the ecological and economic efficiency of the combined method compared to the maceration method. Due to the reduction of process duration and energy consumption, the carbon footprint of the combined method of phenolic compounds extraction is reduced by 5.8 times, extraction costs are reduced by 3.2 times per 1 g of raw material.
1. Введение
Современным трендом обращения с растительными отходами в агропромышленном комплексе в рамках биоэкономики становится глубокая переработка с получением ценных биологически активных веществ (БАВ). Глубокая переработка способствует устойчивому использованию отходов растениеводства и достижению Цели 2 ЦУР «Ликвидация голода, обеспечение продовольственной безопасности и улучшение питания, и содействие устойчивому развитию сельского хозяйства»
. Повторное использование отходов в производственной цепочке — один из важнейших принципов биоэкономики.Одним из основных преимуществ переработки растительных отходов с экономической точки зрения является их низкая стоимость по сравнению с другим сырьем. Однако характер таких отходов может создавать ряд проблем с точки зрения безопасности как для человека, так и для окружающей среды.
В связи с этим целесообразно проведение комплексных исследований для поиска эффективной технологии переработки растительных отходов с учетом экономических и экологических аспектов.
Цветная капуста (Brassica oleracea L. var. botrytis) является одной из наиболее потребляемых овощных культур семейства крестоцветных в мире
. Данный представитель семейства Brassicaceae все больше выращивается и потребляется в пищу и в России (РОССТАТ) . В процессе сбора и переработки до 40–60% от массы растения остается неиспользованной на полях и является отходом производства . В настоящее время эти отходы используются в мировой практике в качестве сырья для производства сельскохозяйственных удобрений, кормов для животных и пищевых волокон .Однако исследования последних лет показывают, что листья цветной капусты содержат большое количество биологически активных соединений, в частности фенольные соединения (ФС), обладающие антиоксидантными, противовоспалительными и противоопухолевыми свойствами
. Основными антиоксидантами в культуре являются витамины C и E, каротиноиды и ФС, особенно флавоноиды. Эти антиоксиданты поглощают радикалы и подавляют инициацию цепных реакций свободных радикалов, повреждающих клетки, или прерывают распространение цепи . Помимо витаминов-антиоксидантов цветная капуста содержит большую группу глюкозинолатов, которые, характеризуются довольно низкой антиоксидантной активностью , но продукты их гидролиза обладают онкопротекторными свойствами .В научной литературе есть подтверждения применения муки из листьев и стеблей цветной капусты как источника нутриентов
, , ФС , глюкозинолатов, каротиноидов и фитостеролов для обогащения мучных изделий, нутриентов и оксидантов — для мясных изделий . При этом листья цветной капусты показывают более высокую антиоксидантную активность по сравнению со стеблями растения . В работе приведены результаты исследования влияния экстрактов из листьев цветной капусты на процесс окисления пищевых продуктов; показана высокая потенциальная антибактериальная активность против грамотрицательных бактерий. Экстракты из листьев и стеблей также исследовали в зарубежной практике в качестве источника изотиоцианатов для производства напитков .Таким образом, листья цветной капусты могут быть рассмотрены в качестве побочных продуктов и выступать как недорогой источник ценных биологически активных соединений.
Традиционные методы экстракции ФС, такие как мацерация, перколяция и экстракция в аппарате Сокслета, имеют ряд недостатков, включая длительное время экстракции, высокий расход растворителей и разрушение термолабильных компонентов
. В связи с этим растет интерес к разработке более эффективных и экологически безопасных методов экстракции.Определение эффективного режима экстракции БАВ является одним из ключевых аспектов технологии по переработке растительных отходов, так как именно он влияет на выход веществ из растительной клетки и его биологическую активность.
В листьях цветной капусты, как и в других овощах, ФС можно разделить на связанные ФС, содержащиеся в клеточных стенках, где они связаны с полисахаридами эфирными связями, гидрофобными взаимодействиями и водородными связями, образуя высокомолекулярные соединения, что затрудняет их извлечение, и свободные ФС, содержащиеся в вакуолях растительных клеток
. Для уменьшения потерь БАВ и повышения эффективности процесса экстракции следует использовать методы предварительной обработки, способствующие разрушению и деградации матрицы клеточной стенки, сохраняя их стабильность и антиоксидантную активность .Новые способы экстракции такие как ультразвуковая обработка, обработка ферментными препаратами, способствуют увеличению эффективности экстракции, выходу биологически активных веществ из растительных клеток.
Механизм ферментативной обработки, разрушающей клеточную стенку, заключается в деполимеризации полисахаридов клеточной стенки и гидролизации гликозидных связей между ФС и полимерами клеточных стенок
.Данные свидетельствует о большом потенциале применения ферментной и ультразвуковой обработки для повышения эффективности извлечения природных антиоксидантных соединений из растительных отходов с целью замены синтетических антиоксидантов на биоантиоксиданты и, таким образом, для валоризации остатков растительной биомассы более эффективным способом
.Как и в случае с ферментной обработкой, ультразвуковая экстракция позволяет эффективно сократить расход растворителя и время экстракции ФС из сельскохозяйственных и пищевых отходов. Метод основан на процессе кавитации, который возникает, когда ультразвуковые волны частотой от 20 кГц до 100 МГц проходят через образец в циклах сжатия и расширения. Столкновения между частицами, вызванные схлопыванием кавитационных пузырьков, увеличивают диффузию извлекаемых химических веществ в растворитель
.В научной литературе отсутствуют исследования по оценке эффективности извлечения БАВ из листьев цветной капусты (Brassica oleracea var. botrytis), выращенных в условиях умеренно континентального климата России, с использованием комбинированного метода — ультразвуковой и ферментной обработки.
Целью работы является комплексное исследование эффективности применения комбинированного метода ультразвуковой и ферментной обработки при экстракции ФС из листьев цветной капусты.
2. Объекты и методы исследования
Исследования проводили в 2024 г. в лаборатории факультета экотехнологий Университета ИТМО с использованием следующего оборудования: измельчение с помощью жерновой мельницы «HR3000» (Foodatlas, Китай), мацерация с применением верхнеприводной мешалки OHS-20 (VELP Scientifica, Италия), мощностью 200 Вт; ультразвуковая экстракция с применением УЗ-ванны «Град 40-35» (ООО «НТК Солтек», Россия).
Предварительная обработка листьев заключалась в мойке, просушке при комнатной температуре (+23 ℃) в темном помещении на протяжении 7 суток. Подготовленное сырье хранилось в сухом темном помещении. Измельчение и отбор проб размером от 1 до 2 мм с помощью сит проводилось непосредственно перед проведением исследования.
Для установления рациональной дозы внесения ферментных препаратов был проведен двухфакторный эксперимент по экстракции с ультразвуковой обработкой при равных условиях согласно матрице эксперимента. Перед экстракцией раствор, содержащий сырье и смесь ферментных препаратов выдерживалась на протяжении 10 мин в ультразвуковой ванне при заданной температуре в 50 ℃. Ультразвуковая обработка проводилась на протяжении 10 мин при минимальной мощности УЗ в 30% (49,5 Вт), частота 35 кГц, при температуре 50 С, гидромодуль 1:40.
После экстракции раствор оставляли для остывания до комнатной температуры и фильтровали, после проводилось измерение содержания ФС.
В качестве компонентов смеси ферментных препаратов использовались отечественные препараты «Пектиназа» и «Целлюлаза» («Биопрепарат», Россия). Для экспериментальных исследований были установлены следующие параметры применения ферментных препаратов: температура 50 ℃ и рН 4,0. Данные значения приняты исходя из оптимальных диапазонов, заявленных производителем.
Для установления рационального режима экстракции при совместном действии ультразвука и смеси ферментных препаратов был проведен полный факторный эксперимент (ПФЭ) типа 2n, где n — число факторов варьирования, и метод «крутого» восхождения
.Содержание ФС определяли спектрофотометрическим методом с применением фенольного реактива Фолина–Чокальтеу
. Оптическую плотность растворов определяли на спектрофотометре ПЭ-5400УФ («Промэколаб», Россия), кварцевые кюветы с толщиной слоя 1 см, при длине волны 765 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Содержание ФС в мг/г рассчитывали по калибровочной кривой в эквиваленте галловой кислоты сырья. Содержание ФС пересчитывали в мг на 100 г сухих листьев цветной капусты.Полученные данные обрабатывались методами математической статистики: проверялась воспроизводимость опытов с помощью критерия Кохрена (Gp); рассчитывались коэффициенты регрессии; оценивалась их значимость; составлялись уравнения регрессии; рассчитывались значения функции отклика. Статистическая обработка проводилась с использованием программы Microsoft Excel по критерию Стьюдента (3,18)
.При определении себестоимости ФС учитывали затраты на приобретение экстрагентов — питьевой воды по тарифу Ленинградской области – 63,65 руб./м3 и этилового спирта 96,3% (ГОСТ 5962-2013) по цене 680 руб. за 1 л. Затраты на электроэнергию рассчитывали по потреблению электроэнергии в процессе экстракции по тарифу — 8, 51 руб./кВт-ч.
Для оценки углеродного следа процесса экстракции, как суммарного выброса парниковых газов, образующихся в результате потребления электроэнергии и экстрагентов, применялся программный продукт SimaPro 9.1.1.1 с базой данных Ecoinvent; расчет проводился по методу IPCC 2013 GMP 500
. Расчеты приводились для 1 г сухого сырья. Дополнительно приведены расчеты для 1 мг ФС для возможности интерпретации результатов исходя из целей будущих исследований.3. Результаты и обсуждения
Результаты эксперимента по установлению рациональной дозы внесения смеси ферментных препаратов представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Результаты двухфакторного эксперимента экстракции БАВ для установления дозы смеси ферментных препаратов
№ | Кодированная размерность факторов | Натуральная размерность факторов | Общее содержание ФС, мг/100 г | ||
X1 | Х2 | Доза ферментного препарата, % | Соотношение пектиназы к целлюлазе | ||
1 | -1 | +1 | 1,5 | 1:1 | 569,22±3,12 |
2 | -1 | -1 | 1,5 | 1:2 | 587,42±2,89 |
3 | +1 | +1 | 2,5 | 1:1 | 575,93±2,92 |
4 | +1 | -1 | 2,5 | 1:2 | 592,21±2,49 |
После проведения экспериментов и статистической обработки данных получено уравнение регрессии, отражающее корреляцию между общим содержанием ФС в экстракте из листьев цветной капусты и дозой ферментного препарата (формула 1). Оценка значимости коэффициентов регрессии показала, что коэффициенты b2, b12 не обладают статистической значимостью.
где Y2 — общее содержание ФС при, X1 — доза ферментного препарата, мл/г.
Из уравнения регрессии (1) видно, что увеличение дозы смеси ферментных препаратов положительно влияет на выход ФС.
Рациональная дозировка ферментных препаратов для работы определена следующая: дозы смеси ферментных препаратов 3% и соотношение пектиназы к целлюлазе 1:3.
В таблице 2 представлены результаты полного факторного эксперимента экстракции БАВ с применением ультразвуковой и ферментной обработки в водном растворе.
Таблица 2 - Результаты ПФЭ эксперимента экстракции ФС из листьев цветной капусты с применением ферментной и ультразвуковой обработки в водном растворе
№ | Кодированная размерность факторов | Натуральная размерность факторов | Общее содержание ФС, мг/100 г | ||||
X1 | Х2 | Х3 | Гидромодуль, мл/г | Время экстракции, мин | Мощность ультразвука, Вт (Вт/г) | ||
1 | -1 | -1 | -1 | 30 | 30 | 99 (3,19) | 557,51±2,39 |
2 | -1 | +1 | -1 | 30 | 40 | 99 (2,41) | 572,67±1,71 |
3 | +1 | -1 | -1 | 40 | 30 | 99 (3,19) | 564,53±2,42 |
4 | +1 | +1 | -1 | 40 | 40 | 99 (2,41) | 532,98±3,93 |
5 | +1 | -1 | +1 | 40 | 30 | 115,5 (3,72) | 438,19±2,80 |
6 | -1 | +1 | +1 | 30 | 40 | 115,5 (2,81) | 463,44±2,61 |
7 | -1 | -1 | +1 | 30 | 30 | 115,5 (3,72) | 453,88±1,39 |
8 | +1 | +1 | +1 | 40 | 40 | 115,5 (2,81) | 456,027±1,82 |
После статистической обработки данных получено уравнение регрессии (2):
где Y2 — общее содержание ФС при, X2 – время экстракции, мин, мощность ультразвука (Вт).
Был определен следующий рациональный режим экстракции ФС из листьев цветной капусты в водном растворе с комбинированным применением ультразвуковой и ферментной обработки: гидромодуль — 20 мл/г; продолжительность экстракции — 60 мин; мощность ультразвука — 49,5 Вт (2,36 Вт/г).
Полученные результаты согласуются с исследованием
, авторы которого подтвердили на примере кожуры папайи, что при сочетании ультразвуковой обработки с ферментативной эффективность процесса экстракции может быть повышена. Выход полифенолов увеличивается более чем на 72,95% и продолжительность процесса сокращается в 6 раз по сравнению с экстракцией без ультразвуковой обработки.Ранее авторами были получены результаты экспериментального исследования экстракции методом мацерации в водно-спиртовом растворе со следующими параметрами: гидромодуль (отношение сырья к экстрагенту) был установлен на уровне 1:45, продолжительность экстракции при комнатной температуре составила 70 мин. Максимальное содержание ФС в экстракте составляло 580,89 мг/100 г сырья. По сравнению с методом мацерации в водно-спиртовом растворе комбинированная ультразвуковая и ферментная обработка позволила уменьшить гидромодуль в 2,25 раза, сократить продолжительность в 1,2 раза, увеличить выход ФС на 57%.
Результаты данного исследования соответствуют выводам авторов
, которые в процессе извлечения ФС из кожуры грейпфрута (Citrus paradisi L.) с помощью ультразвуковой обработки подтвердили снижение продолжительности экстракции до 30 мин, в то время как ферментная обработка показала высокий выход ФС после 4 часов гидролиза. Однако экстракт, полученный после обработки ферментами, показал наибольший выход БАВ.Данное положение подтверждается результатами аналогичных исследований зарубежных авторов в работе
. Сравнение продолжительности ультразвуковой экстракции ФС и витамина С из плодов ацеролы (Malpighia emarginata DC) и экстракции с ферментативным гидролизом показывает снижение продолжительности ультразвуковой обработки до 6 мин по сравнению со 120 мин при применении целлюлолитических ферментных препаратов без ультразвуковой обработки.Сокращение продолжительности комбинированной обработки можно объяснить тем, что ультразвуковая обработка вызывает деструкцию клеточных стенок растительного сырья, способствуя высвобождению ФС, тогда как ферментная обработка расщепляет полисахариды клеточной структуры, что в совокупности приводит к максимальному извлечению БАВ.
Для сравнительной оценки экологических аспектов извлечения ФС был рассмотрен углеродный след комбинированного метода и мацерации.
Результаты оценки углеродного следа (рис. 1) показывают, что наибольший вклад при всех методах экстракции (99%) вносит электропотребление, поэтому, для его снижения необходимо сокращение продолжительности процесса.
Рисунок 1 - Вклад ресурсов, потребляемых в процессе экстракции ФС, в углеродный след
Важность учета экологических аспектов при выборе режимов экстракции рассматривается в работе
, в ней авторы аргументируют, что применение ультразвуковой экстракции позволяет заменить токсичные экстрагенты (метанол, этанол) на менее токсичные (вода), что приводит к экологизации процессов экстракции и, следовательно, снижает экологическую нагрузку и повышает экологическую эффективность производства БАВ.Выбор рационального режима экстракции ФС из листьев цветной капусты подразумевает также оценку затрат на реализацию рассмотренных методов (рис. 2).
Рисунок 2 - Затраты на экстракцию ФС
Таким образом, совместное применение ультразвуковой и ферментной обработки приводит к снижению энергопотребления за счет сокращения ее продолжительности, поэтому данный метод является потенциально экологически и экономически эффективным по сравнению с методом мацерации.
В дальнейшем для данного комбинированного метода планируется определить количественное содержание не только ФС, но и др. БАВ в экстракте из листьев цветной капусты, включая антиоксиданты (аскорбиновую кислоту, каротиноиды) и соединения с онкопротекторной активностью (глюкозинолаты), что позволит более полно обосновать его экономическую эффективность.
4. Заключение
Повышение экологической эффективности экстракции требует поиска рациональных режимов экстракции, так как этот этап в производстве играет важную роль в получении ценной продукции — ФС из листьев цветной капусты.
Результаты проведенного комплексного исследования подтверждают эффективность экстракции ФС из листьев цветной капусты с комбинированием ультразвуковой обработки и применения ферментных препаратов. Наиболее рациональными параметрами являются следующие: гидромодуль — 20 мл/г; продолжительность экстракции – 60 мин; мощность ультразвука — 49,5 Вт (2,36 Вт/г). Установлены рациональная доза внесения ферментных препаратов в количестве 3% от массы сырья и соотношение пектиназы к целлюлазе 1:3.
Предложенный метод приводит к снижению углеродного следа в 5,8 раз и снижению затрат в 3,2 раза по сравнению с методом мацерации, что подтверждает экологическую и экономическую эффективность комбинированного метода.
Применение листьев цветной капусты в качестве источника БАВ может быть достаточно широко использовано в России для получения из отходов агропромышленного комплекса ценных антиоксидантных соединений для пищевой промышленности.