AN EVALUATION OF ALLOPURINOL USE IN ISCHAEMIA REPERFUSION KIDNEY INJURY IN RATS IN AN EXPERIMENT
AN EVALUATION OF ALLOPURINOL USE IN ISCHAEMIA REPERFUSION KIDNEY INJURY IN RATS IN AN EXPERIMENT
Abstract
Atomic forms of oxygen mediate post-ischaemic reperfusion injury in kidneys. The aim of the study was to evaluate the nephroprotective effect of allopurinol in post-ischaemic renal reperfusion injury in rats in an experiment. Creatinine values in group 2 and 3 reached maximum values by day 3, from the moment of surgery, and 24 hours after the beginning of the experiment in group 3 urea index was 24.9% statistically significantly lower in comparison with group 2, p<0.05. Allopurinol application statistically significantly reduced functional and histological abnormalities observed on the 1st,3rd and 7th day. The use of allopurinol in ischaemia-reperfusion may have tremendous practical output, but further research is required.
1. Введение
Ишемическая почечная дисфункция наблюдается при многих клинических ситуациях, включая шок, трансплантацию почки и сердечно-сосудистую хирургию. Патофизиологическим механизмом выступает почечная гипоперфузия. Атомарные формы кислорода (АФК) выступают медиаторами постишемического реперфузионного повреждения в почках и других органах
. Применение аллопуринола с целью блокады активности ксантиноксидазы и ингибирования активности АФК является крайне перспективным , . Цель исследования – оценка нефропротективного эффекта аллопуринола при постишемическом реперфузионном повреждении почек у крыс в эксперименте.2. Методы и принципы исследования
Все манипуляции с животными проводились в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных
. Эксперимент проводился на 30 животных (нелинейные белые крысы обоего пола массой 290-325 г.). Все животные находились в стандартных условиях вивария. Всем животным был предоставлен свободный доступ к стандартному лабораторному корму и воде. Животным выполнен (наркоз), включающее интраперитонеальное введение (и/п) препаратов: «Ксилазин» (0,5 мл/кг массы тела) и «Золетил 100» (8мг/кг массы тела) . Животные были разделены на 3 группы: 1-ая группа (контроль 1) (n=10) ложнооперированные животные, выполнялась срединная лапаротомия. Предварительно вводился гепарин натрия (200 ЕД/кг) в хвостовую вену, брюшная полость накрывалась стерильной салфеткой и ч\з 1 час ушивалась. 2-ая – контроль 2 (n = 10): Выполнялась срединная лапаротомия. Предварительно вводился гепарин натрия (200 ЕД/кг) в хвостовую вену. Ножку левой почки зажимали на 1 ч сосудистым зажимом. В этот период брюшная полость закрывалась стерильной салфеткой. За 5 мин до снятия зажима выполнялась правосторонняя нефрэктомия, после чего происходило ушивание брюшной полости . 3-ья – операция+аллопуринол (n = 10): Животным в данной группе был добавлен в пищевой рацион аллопуринол 50 мг (ОРГАНИКА, АО (Россия)) в сутки из расчета на одно животное (аллопуринол был добавлен в пищу за 24 часа до начала эксперимента, предварительно таблетки измельчались до порошка), животные из этой группы содержались в отдельных клетках. Выполнялась срединная лапаротомия. Предварительно вводился гепарин натрия (200 ЕД/кг) в хвостовую вену. Ножку левой почки зажимали на 1 ч сосудистым зажимом. В этот период брюшная полость закрывалась стерильной салфеткой. За 5 мин до снятия зажима выполнялась правосторонняя нефрэктомия, после чего происходило ушивание брюшной полости . Для оценки уровня мочевины и креатинина, образцы крови были взяты из хвостовой вены по стандартной методике, с использованием стандартных диагностических наборов (анализатор BS-240), в сроки: через 24 часа после операции, на 3й день после операции, и на 7-й день после операции. После вывода животных из эксперимента путем эвтаназии, проводилось гистопатологическое исследование почек (предварительно ткани фиксировали в 10% формальдегиде, обезвоживали в спиртовой серии, обрабатывали толуолом, готовили парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике), делали микрофотографии, отцифровывали их и оценивали изменения. Для статистической обработки был применен t-критерия Стьюдента и критерий Манна-Уитни. Результаты представлены следующим образом, М ± m (М – среднее, m – ошибка среднего). Данные принимались за статистически значимые при р<0,05 .3. Результаты и их обсуждение
Значения креатинина в группе 2 и 3 достигли максимальных значений к 3-му дню, с момента операции (таб. 1), так спустя 24 часа с момента начала эксперимента в группе 3 показатель мочевины был на 24,9% статистически значимо ниже в сравнении с группой 2, р<0,05.
Таблица 1 - Показатели мочевины и креатинина в исследуемых группах
Показатель плазмы крови | Группа 1. Kонтроль 1. Ложнооперированные животные (n = 10), (М±m) | Группа 2. Kонтроль 2. Операция без лечения (n = 10), (М±m) | Группа 3. Операция+аллопуринол (n = 10), (М±m) |
Мочевина, (ммоль/л) | Через 24 часа от начала эксперимента | ||
1,534±0,178 | 5,983± 0,228* | 4,493± 0,662# | |
3й день после операции | |||
1,544±0,478 | 9,273± 0,138* | 6,703± 0,587*# | |
7-й день после операции | |||
1,534±0,181 | 8,653± 1,168 | 5,284± 0,943# | |
Креатинин, (мкмоль/л) | Через 24 часа от начала эксперимента | ||
39,78 ± 7,53 | 49,5 ± 4,51* | 45,08 ± 2,33*# | |
3й день после операции | |||
39,88 ± 7,14 | 89,7 ± 4,68* | 61,13 ± 3,53*# | |
7-й день после операции | |||
39,79 ± 7,11 | 71,5 ± 6,55* | 55,08 ± 4,33*# |
Примечание: * - статистическая значимость отличия по отношению к группе 1, р<0,05; # - статистическая значимость отличия по отношению к группе 2, р<0,05
В контрольной группе значения стабильно увеличивались до 3-го дня, а затем снижались. Показатель креатинина в группе 3 был статистически значимо ниже по сравнению с контрольной группой во все дни, (p <0,05). Так, наивысший уровень креатинина в группе 3 был зафиксирован на 3-и сутки от начала эксперимента - 61,13 ± 3,53 мкмоль/л, что статистически значимо ниже в сравнении с группой контроль 2, на 31,8%, р<0,05 (таб.1.). При гистологической оценке препаратов максимальное повреждение с выраженным некрозом в дистальной трети проксимального извитого канальца и участком некроза, распространяющегося вдоль мозгового слоя было отмечено у животных в группе №2, в группе №3 также отмечались подобные изменения, но они носили менее выраженный характер, отмечались участки лимфогистиоцитарной инфильтрации стромы, увеличение мезангиального матрикса и дистрофия эпителия канальцев. В отличие от других органов ишемически-реперфузионное повреждение почек уникально в том, что в момент ишемии происходит, и морфологическое, и функциональное повреждение почки
, . В данном исследовании, мы постарались показать, что применение аллопуринола оказывает нефропротективный эффект при ишемически-реперфузионном повреждении почек у крыс в эксперименте. В нашем исследовании мы увидели положительный эффект, начиная с ранней фазы реперфузии (24 часа). Эффекты аллопуринола до конца не изучены, и предполагаемые механизмы включают ингибирование образования АФК системой ксантиноксидазы , , и прямое удаление свободных радикалов.4. Заключение
Применение аллопуринола оказывает нефропротективный эффект при ишемически-реперфузионном повреждении почек у крыс в эксперименте. Мы предполагаем, что нефропротективное действие аллопуринола при ишемии-реперфузии осуществляется все-таки не через механизм ингибирования ксантиноксидазы, а через стабилизацию митохондриальных мембран, но проверка данной гипотезы требует дальнейших исследований. Во время ранней реперфузии наблюдается снижение общего почечного кровотока, а также притока крови к корковому и мозговому слою, происходит ингибирование канальцевой реабсорбции натрия, хлоридов и воды, тем самым снижается канальцевое потребление кислорода и уменьшается агрегации тромбоцитов, возникающая после повреждения тканей. Применение аллопуринола статистически значимо уменьшало функциональные и гистологические нарушения, наблюдаемые на 1ые, 3-и и 7-е сутки. Применение аллопуринола при шоке, трансплантации почки и сердечно-сосудистой хирургии, может иметь колоссальный практический выход, но требуется дальнейшее проведение исследований, оценки баланса оксидантно-антиоксидантного статуса, модуляции обмена веществ, кроме того, необходимо оценить, каким образом мембранные белки, регулирующие ксантиноксидазу оказывают воздействие при ишемии-реперфузии почек.