OXIDASE ACTIVITY OF CERIUM OXIDE NANOPARTICLES
OXIDASE ACTIVITY OF CERIUM OXIDE NANOPARTICLES
Abstract
Cerium oxide nanoparticles are a promising material for biomedical applications due to their ability to perform enzyme functions. The present research demonstrates the nanoparticle ability to imitate oxidase enzyme. The oxidase activity of cerium dioxide nanoparticles was studied by using a buffer solution and 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine chromogenic substrate (TMB). The kinetic parameters values of the TMB oxidation process (Michaelis constant, maximum reaction rate, catalytic constant) were calculated. The results of a study in the oxidase activity of maltodextrin-coated cerium oxide nanoparticles are presented. This activity strongly depends on the solution pH.
1. Введение
В настоящее время ключевую роль среди наноэнзимов играют наноматериалы на основе диоксида церия. Наночастицы диоксида церия (НДЦ) вызывают большой интерес из-за широкого спектра применения в различных областях, таких как топливные элементы , датчики газа , поглотители ультрафиолета , и биомедицинские приложения . НДЦ представляют интерес для медицины благодаря своей способности участвовать в процессах окисления-восстановления, обусловленной кислородной нестехиометрией. Именно присущая НДЦ кислородная нестехиометрия, образующаяся при удалении кислорода с поверхности, отвечает за его уникальную биологическую активность.
В зависимости от водородного показателя среды НДЦ проявляют как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства. Уникальность НДЦ заключается в возможности селективного уничтожения опухолевых клеток, которые характеризуются более кислым значением pH по сравнению со здоровыми. С одной стороны, в нейтральной среде наночастицы демонстрируют антиоксидантные свойства, что приводит к уменьшению окислительного стресса. С другой стороны, с уменьшением pH НДЦ наиболее активно проявляют прооксидантные свойства. В этом случае производство АФК увеличивается, а значит, гибель опухолевых клеток происходит эффективнее .
В литературе большое внимание уделяется исследованию антиоксидантных и прооксидантных свойств наночастиц СеО2, а также изучению его мультиферментативной активности, т.е. способности выполнять функции ферментов супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы и оксидазы .
Однако в литературе в настоящее время отсутствуют результаты комплексных исследований влияния кислотности среды на оксидазную активность наночастиц оксида церия. Более тщательное изучение этой темы, установление зависимости между этими параметрами позволит использовать НДЦ в качестве терапии для избирательного уничтожения злокачественных образований.
2. Методы и принципы исследования
Наночастицы оксида церия CeO2 в мальтодекстриновой оболочке были получены методом осаждения согласно методике, представленной в работе . Концентрация приготовленной суспензии наночастиц составила 10 мг/мл. С целью предотвращения образования агломератов частиц приготовленная суспензия подвергалась 30-минутной ультразвуковой обработке в ванне ПСБ-Галс. Для моделирования кислотности среды были приготовлены уксусно-ацетатные растворы трех значений pH: 4,0; 5,0; 6,0. Величина pH растворов контролировалась с помощью лабораторного иономера И-160МИ.
Оксидазная активность наночастиц церия была исследована с использованием буферного раствора и хромогенного субстрата 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ). В работе проведена серия опытов с разными значениями pH среды. Таблица 1 содержит список реагентов с указанием объемов и концентраций.
Таблица 1 - Объемы и концентрации реагентов
Реагент | Буфер, pH=4,0; 5,0; 6,0 | НДЦ | ТМБ |
Концентрация, мг/мл | - | 10 | 5 |
Объем, мкл | 4000 | 80 | 10; 20; 40; 60; 80 |
Измерения зависимостей оптической плотности растворов от времени были проведены с использованием спектрофотометра ПЭ-5400УФ на длине волны 652 нм в течение 300 секунд. Затем из значений оптической плотности растворов была рассчитана концентрация продукта окисления ТМБ в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера, при этом коэффициент молярного поглощения взят равным 39000 (моль/л)-1см-1 .
Согласно модели Михaэлисa – Ментен, при увеличении концентрации субстрaтa до определенного уровня скорость реакции достигает максимума:
где υ – скорость реакции при определенной концентрации субстрата;
υmax – максимальная скорость ферментативной реакции;
[S] – концентрация субстрата;
KM – константа Михаэлиса.
Путем линеаризации уравнения Михaэлисa – Ментен можно получить уравнение Лайнуивера- Берка (2):
где 1/υmax –пересечение с осью ординат;
KM /υmax – тангенс угла наклона прямой;
1/ KM –отрезок, отсекаемый на оси абсцисс.
3. Основные результаты и обсуждение
Рисунок 1 - Зависимость оптической плотности окисленного ТМБ от времени при концентрации субстрата ТМБ 0,8 ммоль/л на длине волны 652 нм в присутствии НДЦ при pH 4,0; 5,0; 6,0
Рисунок 2 - Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=4,0
Рисунок 3 - Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=5,0
Рисунок 4 - Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=6,0
Рисунок 5 - График Лайнуивера-Берка при pH=4,0
Рисунок 6 - График Лайнуивера-Берка при pH=5,0
Рисунок 7 - График Лайнуивера-Берка при pH=6,0
Таблица 2 - Основные кинетические параметры процесса окисления ТМБ
Кинетический параметр | pH=4,0 | pH=5,0 | pH=6,0 |
[E], ммоль/л | 0,408 | ||
KM, ммоль/л | 0,134 | 0,216 | 0,373 |
υmax, мкмоль/л с | 0,587 | 0,252 | 0,053 |
kcat, 10-3 с-1 | 1,436 | 0,616 | 0,130 |
kcat/ KM, л/с моль | 10,739 | 2,848 | 0,349 |
где [E] – концентрация наночастиц CeO2;
KM – константа Михаэлиса;
υmax - максимальная скорость реакции;
kcat – каталитическая константа,
где kcat=υmax/[E];
kcat/ KM характеризует каталитическую эффективность наноэнзима.
Из таблицы видно, что значение KM наименьшее при pH среды равном 4,0. Как известно, более низкое значение константы Михаэлиса свидетельствует о более быстром и предпочтительном связывании субстрата с ферментом, т. е. о более высоком сродстве фермента к данному субстрату. Наибольшая скорость реакции и каталитическая эффективность также наблюдается при pH=4,0.
Таким образом, окисление хромогенного субстрата ТМБ в присутствии оксида церия свидетельствует об оксидазной активности наночастиц, при этом с уменьшение pH среды данный тип активности увеличивается.
4. Заключение
В данной работе было проведено исследование оксидазной активности наночастиц СеО2, стабилизированных мальтодекстрином, в зависимости от условий внешней среды, а именно – от величины кислотности среды. Установлено, что ферментативная активность наночастиц СеО2 сильно зависит от pH среды. Показано, что наночастицы наиболее активно проявляют оксидазные свойства в кислой среде, а при увеличении рН их активность снижается.
Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали прооксидантные свойства наночастиц оксида церия, которые в значительной степени зависят от условий внешней среды. Возможное использование наночастиц СеО2 в медицине в качестве прооксидантов требует дальнейшего глубокого исследования их свойств и биологической активности.