1. Введение
В настоящее время ключевую роль среди наноэнзимов играют наноматериалы на основе диоксида церия. Наночастицы диоксида церия (НДЦ) вызывают большой интерес из-за широкого спектра применения в различных областях, таких как топливные элементы [1], датчики газа [2], поглотители ультрафиолета [3], и биомедицинские приложения [4]. НДЦ представляют интерес для медицины благодаря своей способности участвовать в процессах окисления-восстановления, обусловленной кислородной нестехиометрией. Именно присущая НДЦ кислородная нестехиометрия, образующаяся при удалении кислорода с поверхности, отвечает за его уникальную биологическую активность.
В зависимости от водородного показателя среды НДЦ проявляют как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства. Уникальность НДЦ заключается в возможности селективного уничтожения опухолевых клеток, которые характеризуются более кислым значением pH по сравнению со здоровыми. С одной стороны, в нейтральной среде наночастицы демонстрируют антиоксидантные свойства, что приводит к уменьшению окислительного стресса. С другой стороны, с уменьшением pH НДЦ наиболее активно проявляют прооксидантные свойства. В этом случае производство АФК увеличивается, а значит, гибель опухолевых клеток происходит эффективнее [5].
В литературе большое внимание уделяется исследованию антиоксидантных и прооксидантных свойств наночастиц СеО2, а также изучению его мультиферментативной активности, т.е. способности выполнять функции ферментов супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы и оксидазы [6].
Однако в литературе в настоящее время отсутствуют результаты комплексных исследований влияния кислотности среды на оксидазную активность наночастиц оксида церия. Более тщательное изучение этой темы, установление зависимости между этими параметрами позволит использовать НДЦ в качестве терапии для избирательного уничтожения злокачественных образований.
2. Методы и принципы исследования
Наночастицы оксида церия CeO2 в мальтодекстриновой оболочке были получены методом осаждения согласно методике, представленной в работе [7]. Концентрация приготовленной суспензии наночастиц составила 10 мг/мл. С целью предотвращения образования агломератов частиц приготовленная суспензия подвергалась 30-минутной ультразвуковой обработке в ванне ПСБ-Галс. Для моделирования кислотности среды были приготовлены уксусно-ацетатные растворы трех значений pH: 4,0; 5,0; 6,0. Величина pH растворов контролировалась с помощью лабораторного иономера И-160МИ.
Оксидазная активность наночастиц церия была исследована с использованием буферного раствора и хромогенного субстрата 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ). В работе проведена серия опытов с разными значениями pH среды. Таблица 1 содержит список реагентов с указанием объемов и концентраций.
Объемы и концентрации реагентов
| Реагент | Буфер, pH=4,0; 5,0; 6,0 | НДЦ | ТМБ |
| Концентрация, мг/мл | - | 10 | 5 |
| Объем, мкл | 4000 | 80 | 10; 20; 40; 60; 80 |
Измерения зависимостей оптической плотности растворов от времени были проведены с использованием спектрофотометра ПЭ-5400УФ на длине волны 652 нм в течение 300 секунд. Затем из значений оптической плотности растворов была рассчитана концентрация продукта окисления ТМБ в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера, при этом коэффициент молярного поглощения взят равным 39000 (моль/л)-1см-1 [8].
Согласно модели Михaэлисa – Ментен, при увеличении концентрации субстрaтa до определенного уровня скорость реакции достигает максимума:
[LATEX_FORMULA]\upsilon=\frac{\upsilon_{max}\cdot[S]}{[S]+K_M}[/LATEX_FORMULA]
где υ – скорость реакции при определенной концентрации субстрата;
υmax – максимальная скорость ферментативной реакции;
[S] – концентрация субстрата;
KM – константа Михаэлиса.
Путем линеаризации уравнения Михaэлисa – Ментен можно получить уравнение Лайнуивера- Берка (2):
[LATEX_FORMULA]\frac{1}{\upsilon}=\frac{K_M}{\upsilon_{max}\cdot[S]}+\frac{1}{\upsilon_{max}}[/LATEX_FORMULA]
где 1/υmax –пересечение с осью ординат;
KM /υmax – тангенс угла наклона прямой;
1/ KM –отрезок, отсекаемый на оси абсцисс.
3. Основные результаты и обсуждение
Зависимость оптической плотности окисленного ТМБ от времени при концентрации субстрата ТМБ 0,8 ммоль/л на длине волны 652 нм в присутствии НДЦ при pH 4,0; 5,0; 6,0
Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=4,0
Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=5,0
Кинетика протекающей реакции окисления ТМБ при pH=6,0
График Лайнуивера-Берка при pH=4,0
График Лайнуивера-Берка при pH=5,0
График Лайнуивера-Берка при pH=6,0
Приготовленные растворы с различными значениями pH: 4,0; 5,0; 6,0 и одинаковым количеством ТМБ (0,8 ммоль/л) имеют различный оттенок, что говорит о разной оксидазной активности фермента. Из рисунка 1 следует, что в более щелочной среде активность фермента уменьшается.Для дальнейшего расчета констант были измерены кинетические кривые образцов при одинаковых концентрациях наночастиц оксида церия (CeO2), но различных концентрациях субстрата (ТМБ: 0,1 ммоль/л, 0,2 ммоль/л, 0,4 ммоль/л, 0,6 ммоль/л, 0,8 ммоль/л). Полученные кривые приведены на рисунках 2-4.Далее была произведена обработка полученных кинетик по модели Лайнуивера-Берка, для этого были определены тангенсы углов наклона начальных участков графиков для кинетических кривых. Построенные в обратных координатах зависимости начальных скоростей реакции от концентрации субстрата ТМБ при разных значения pH среды представлены на рисунках 5-7.Рассчитанные по построенным графикам значения кинетических параметров приведены в таблице 2.
Основные кинетические параметры процесса окисления ТМБ
| Кинетический параметр | pH=4,0 | pH=5,0 | pH=6,0 |
| [E], ммоль/л | 0,408 | ||
| , ммоль/л | 0,134 | 0,216 | 0,373 |
| с | 0,587 | 0,252 | 0,053 |
| -1 | 1,436 | 0,616 | 0,130 |
| моль | 10,739 | 2,848 | 0,349 |
где [E] – концентрация наночастиц CeO2;
KM – константа Михаэлиса;
υmax - максимальная скорость реакции;
kcat – каталитическая константа,
где kcat=υmax/[E];
kcat/ KM характеризует каталитическую эффективность наноэнзима.
Из таблицы видно, что значение KM наименьшее при pH среды равном 4,0. Как известно, более низкое значение константы Михаэлиса свидетельствует о более быстром и предпочтительном связывании субстрата с ферментом, т. е. о более высоком сродстве фермента к данному субстрату. Наибольшая скорость реакции и каталитическая эффективность также наблюдается при pH=4,0.
Таким образом, окисление хромогенного субстрата ТМБ в присутствии оксида церия свидетельствует об оксидазной активности наночастиц, при этом с уменьшение pH среды данный тип активности увеличивается.
4. Заключение
В данной работе было проведено исследование оксидазной активности наночастиц СеО2Missing Mark : sub, стабилизированных мальтодекстрином, в зависимости от условий внешней среды, а именно – от величины кислотности среды. Установлено, что ферментативная активность наночастиц СеО2Missing Mark : sub сильно зависит от pH среды. Показано, что наночастицы наиболее активно проявляют оксидазные свойства в кислой среде, а при увеличении рН их активность снижается.
Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали прооксидантные свойства наночастиц оксида церия, которые в значительной степени зависят от условий внешней среды. Возможное использование наночастиц СеО2 в медицине в качестве прооксидантов требует дальнейшего глубокого исследования их свойств и биологической активности.