STUDY OF ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY OF CYANOTHIOACETAMIDE DERIVATIVES IN DRUG-INDUCED OSTEOMYELITIS OF THE MANDIBLE

Целью работы являлся анализ клинической картины медикаментозного бисфосфонат-обусловленного остеомиелита нижней челюсти, а также изучение противовоспалительной активности новых производных цианотиоацетамида.

Бисфосфонаты (БФ) являются ведущими препаратами для лечения заболеваний скелета, характеризующихся повышенной резорбцией костей, включая метастатические заболевания костей, множественную миелому, болезнь Педжета, остеопороз и другие

Остеонекроз развивается в челюсти, поскольку эта кость имеет более высокую скорость ремоделирования, что делает ее более подверженной воздействию БФ

БФ также оказывают прямое токсическое действие на мягкие ткани

Производные цианотиоацетамида представляют собой перспективный класс органических соединений, которые могут иметь разнообразные химические структуры и свойства

Побочные эффекты со стороны желудочно-кишечного тракта являются наиболее распространенной причиной прекращения приема пероральных бисфосфонатов. Риск увеличивается у пациентов, которые принимают сопутствующие НПВП.

Эксперимент реализован на 70 белых беспородных крысах-самцах массой 270-300 г. в зимне-весенний период в лаборатории кафедры фундаментальной и клинической фармакологии ФГБОУ ВО «Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки» МЗ РФ. Животные получены из вивария вуза, где находились под карантинным наблюдением в течение 2 недель до начала эксперимента. Условия содержания крыс соответствовали стандартным требованиям: температура окружающей среды – 22-24º С; режим освещения – естественный; относительная влажность воздуха – 40-50% свободный доступ к воде и пище. Исследования проводили в соответствии с правилами качественной лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. №708н), а также правилами и Международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997) и были одобрены локальным этическим комитетом. Перед началом опыта все лабораторные животные были тщательно осмотрены, учитывались их вес, возраст, двигательная активность и состояние шерстяного покрова. После взвешивания на электронных весах были сформированы однородные по массе (разница не более 10%), поведению и состоянию контрольная и 6 опытных групп методом случайной выборки:

- Контрольная группа №1, животные, которые получали еженедельно в течение месяца внутрибрюшинно 0,9% раствор NaCl в объеме 0,5 мл.

- Опытные группы № 2-7, животным которых еженедельно в течение месяца внутрибрюшинно вводился препарат золедроновой кислоты в дозировке 0,017мг/ 300г. Доза золедроновой кислоты была рассчитана методом прямого межвидового переноса доз, выраженных в мг/кг. При переносе были учтены все аспекты ФК, включая абсорбцию, распределение, метаболизм, экскрецию, а также имеющиеся данные по фармакологическим и токсическим эффектам препарата.

Через 1 месяц от начала эксперимента была проведена операция по препарированию нижней челюсти. Для вхождения в наркоз животные получали внутрибрюшинно 0,5-0,7 мл 0,1% раствора Тиопентала натрия. После этого производилось отслаивание слизистого лоскута и препарирование фронтального сегмента нижней челюсти на 0,2 мм дистальнее правого нижнего резца (рис.1).

Рисунок 1 - Моделирование на начальных этапах медикаментозного остеомиелита крысам опытных групп

Примечание: операция по препарированию сегмента нижней челюсти с целью развития бисфосфонат-обусловленного остеомиелита и анализа противовоспалительных свойств новых производных цианотиоацетамида

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.1

Животные находились на стерильном стандартном твердом корме для грызунов и стерильной воде, за исключением первых 72 часов после операции, когда пища была мягкой, что необходимо для послеоперационного восстановления и облегчения ее приема. Для чистоты эксперимента в течение первых двух недель животным не вводились противовоспалительные и антибактериальные препараты. Рентгенографическое исследование головы и шеи проводилось через 2 недели после оперативного вмешательства на цифровом рентгеновском аппарате «Вател 1» с рентгеновской трубкой TOSCIBA D-124.

Спустя две недели после хирургического вмешательства с появлением первых симптомов остеомиелита была начата фармакологическая коррекция смоделированного патологического состояния, которая проводилась в опытных группах № 2-6 различными производными α-цианотиоацетамида, синтезированными нами на базе научно-исследовательской лаборатории «ХимЭкс» ФГБОУ ВО «Луганский государственный университет им. Владимира Даля» МОН РФ, а в группе № 7 – препаратом сравнения нимесулид. Дозы производных α-цианотиоацетамида (изучаемых дериватов дигидропиридина и тиенопиридина) и нимесулида в нашем исследовании составили 2,5 мг/кг. В ранее проведенных исследованиях именно в диапазоне доз от 1 до 5 мг соединения этой структуры оказывали выраженный противовоспалительный и анальгетический эффекты. И это составляет от 1/100 от LD50. Исследуемые соединения и препарат сравнения вводились ежедневно в течение двух недель интрагастрально с помощью шприцев объемом 1 мл (минимальный объем для снижения потерь дисперсной фазы во время введения) через зонд размером 1,2 мм на 65 мм. Животные контрольной группы получали внутригастрально 0,9% раствор NaCl в объеме 1 мл. Для приготовления растворов были использованы лабораторные принадлежности и посуда, предварительно простерилизованные термически или химически, в том числе ступки и пестики различных размеров, мерные цилиндры, шпатели, колбы и т.д.

Химические формулы новых гетероциклических соединений, изучаемых в эксперименте, приведены ниже на рис. 2.

Рисунок 2 - Строение молекул изучаемых новых оригинальных производных цианотиоацетамида

Примечание: химическая структура производных цианотиоацетамида

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.2

Далее были оценены результаты исследования, отслежена частота встречаемости гнойных осложнений и уровень смертности во всех группах. По истечении срока наблюдения животные (опытных и контрольной групп) были выведены из эксперимента с соблюдением принципов биоэтики (в соответствии со стандартами GLP) путем внутрибрюшинного введения 5% раствора тиопентала натрия из расчета 1 мл на 100 грамм веса животного. При выведении животных из эксперимента производился забор челюстей крыс, содержащих зубы и ткани пародонта, для патоморфологических исследований, кровь из бедренной вены использовали для исследования общего количества лейкоцитов, на основании чего можно судить об уровне воспалительной реакции в организме испытуемых животных. Результаты клинических исследований крови животных опытных групп представлено в таблице №2, 3. Оценку состояния массы тела, внешнего вида, поведения, состояние шерстного покрова, кожи и видимых слизистых оболочек подопытных животных проводили в течение всего периода наблюдения. Взвешивание проводилось еженедельно на протяжение всего эксперимента.

Достоверность различий экспериментальных данных для групп (n<20) определялась с помощью среднего арифметического a; дисперсии значений Ϭ2 вокруг среднего арифметического, среднеквадратического отклонения S в онлайн-калькуляторе allcalc.ru, а также средние значения разности групп сравнения и исследуемых образцов. Однородность полученных экспериментальных данных оценивалась коэффициентом вариации V (при V<33% совокупность данных считалась однородной). В непараметрической статистике применялся критерий Уилкоксона (Wilcoxon matched-pairs signed rank test), который применяется в зависимости от числа групп исследования, связанности выборок и необходимости внесения поправки на множественные сравнения. Статистический критерий Уилкоксона позволял сравнить две связанные (зависимые) выборки по количественному и порядковому признаку.

В динамике наблюдения за животными при оценке массы тела крыс всех исследуемых групп были получены результаты, представленные в таблице 1.

Первые различия между состоянием крыс контрольной и опытных групп стали проявляться на седьмые сутки: приживление слизистого лоскута в области оперативного вмешательства у животных 2-7 групп было замедлено, его цвет был белым, поверхность – матовая, сухая, наблюдалось обильное отложение зубного налета под отслоенной слизистой и в самом костном дефекте. У животных контрольной группы слизистая оболочка десны в области хирургического вмешательства была прикреплена к альвеолярному отростку, место препарирования костной ткани было закрыто, цвет лоскута не отличался от окружающих мягких тканей, был бледно-розовым, его поверхность была блестящая, увлажненная.

На четырнадцатые сутки эксперимента симптомы остеомиелита у крыс шести опытных группах были очевидны (рис. 3).

Рисунок 3 - Состояние области оперативного вмешательства на 14-е сутки эксперимента

Примечание: первые симптомы остеомиелита: костная ткань в области оперативного вмешательства пигментирована, размягчена, обильное отложение зубного налёта, неприятный, гнилостный запах у животных

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.4

У животных с бисфосфонатобусловленным остеомиелитом отмечался болезненный отек мягких тканей со стороны хирургического вмешательства, налет приобрел более зеленый оттенок, неприятный запах изо рта усилился, отмечалось болезненное открывание полости рта, у отдельных крыс зарегистрирована невозможность движения нижней челюсти. У 12 крыс из опытных групп была обнаружена болезненная инфильтрация в подлежащие мягкие ткани, а именно в подчелюстное и правое шейное клетчаточные пространства. Животные были пассивны, безразличны к корму, внешним раздражителям и друг к другу (рис. 4).

Рисунок 4 - Внешний вид крысы опытной группы №3 до фармакологической коррекции медикаментозного остеомиелита

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.5

Следующим этапом экспериментального исследования явилась двухнедельная фармакологическая коррекция бисфосфонатобусловленного остеомиелита в группах №2-6 новыми производными цианотиоацетамида, в группе №7 – препаратом сравнения нимесулидом. 

Через 1 месяц после оперативного вмешательства в контрольной группе животных летальность отсутствовала. Показатели клинического анализа крови крыс этой группы были в пределах нормы, как это видно из данных в таблице 2. На рентгенологическом снимке челюстно-лицевой области в боковой проекции замыкающая пластинка ранее выполненного дефекта разрушена с дистального края в маргинальной области. Структура костных тканей в периапикальных областях и межзубных перегородках не нарушена. Очагов деструкции нет. Патологических очагов гнойной инфильтрации не обнаружено (рис. 5).

Рисунок 5 - Рентгенологический снимок челюстно-лицевой области крысы контрольной группы в боковой проекции

Примечание: на рентгенологическом снимке челюстно-лицевой области в боковой проекции замыкающая пластинка ранее выполненного дефекта разрушена с дистального края в маргинальной области; структура костных тканей в периапикальных областях и межзубных перегородках не нарушена; очагов деструкции нет; патологических очагов гнойной инфильтрации не обнаружено

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.6

Во второй группе животных, получавших через желудочный зонд производное цианотиоацетамида под шифром CV-131, летальность составила 20% (2 животных из 10). В течение эксперимента животные вели себя активно, проявляли интерес к еде, реакция на внешние раздражители была адекватная. Об уровне воспалительной реакции можно судить на основании результатов клинического анализа крови – было выявлено увеличение абсолютного количества лейкоцитов относительно контрольной группы. Если в контрольной группе среднее значение лейкоцитов составило 6,12*10*9/л, то в группе, принимавшей соединение под шифром CV-131 для фармакокоррекции остеомиелита, их среднее значение составило 7,2*10*9/л (табл. 2). На рентгенограмме (рис. 6) замыкающая пластинка выполненного раннее дефекта разрушена с дистального края в маргинальной области. Межзубная перегородка дистальнее правого нижнего резца разрушена, имеет негомогенную структуру. Размеры очага резорбции верхушки альвеолярного гребня составили 0,5х0,5 мм. Патологических очагов гнойной инфильтрации мягких тканей не обнаружено. Полученные результаты свидетельствуют о наличии минимального очага деструкции костной ткани в области препарированного сегмента, значительных морфологических изменений кости не выявлено. Животные данной группы имели минимальный отёк мягких тканей в области оперативного вмешательства, пальпация челюстно-лицевой области была безболезненна.

Рисунок 6 - Рентгенологический снимок челюстно-лицевой области крысы опытной группы, получавшей фармакологическую коррекцию бисфосфонатобусловленного остеомиелита производным цианотиоацетамида с шифром CV-131 в боковой проекции

Примечание: на рентгенограмме замыкающая пластинка выполненного раннее дефекта разрушена с дистального края в маргинальной области; межзубная перегородка дистальнее правого нижнего резца разрушена, имеет негомогенную структуру; размеры очага резорбции верхушки альвеолярного гребня составили 0,5х0,5 мм; патологических очагов гнойной инфильтрации мягких тканей не обнаружено

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.9

В третьей (опытной) группе, животные которой получали новое производное тиодиазина под лабораторным шифром TD-0331, зарегистрирована летальность 20% (2 животных из 10). В ходе эксперимента животные вели себя не так активно, как в опытной группе №2, проявляли незначительный интерес к еде, реакция на внешние раздражители была адекватная. Общее число лейкоцитов в крови крыс данной группы составило 7.2*10*9/л. На рентгенологической картине выявлялся очаг деструкции костной ткани (рис. 7). Межзубная перегородка дистальнее правого нижнего резца разрушена, имела негомогенную структуру.

Рисунок 7 - Рентгенологический снимок челюстно-лицевой области крысы опытной группы, получавшей фармакологическую коррекцию бисфосфонатобусловленного остеомиелита производным тиодиазина с шифром TD-0331, в боковой проекции

Примечание: на рентгенологической картине выявлялся очаг деструкции костной ткани; межзубная перегородка дистальнее правого нижнего резца разрушена, имела негомогенную структуру; выявлен очаг резорбции верхушки альвеолярного гребня диаметром 1,5х1,5 мм; зарегистрирована подвижность нижнего правого резца; морфологические изменения кости проявлялись в её некротическом набухании, а также образовании секвестров; у животных этой группы был минимальный отёк мягких тканей

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.10

Выявлен очаг резорбции верхушки альвеолярного гребня диаметром 1,5х1,5 мм. Зарегистрирована подвижность нижнего правого резца. Морфологические изменения кости проявлялись в её некротическом набухании, а также образовании секвестров. У животных этой группы был минимальный отёк мягких тканей, пальпация челюстно-лицевой области безболезненная.

Смертность животных четвертой группы, которые получали производное цианотиоацетамида из ряда дериватов тиодиазина под шифром TD-0352, составила 40%. После начала введения препарата было отмечено общее улучшение состояния животных: они стали проявлять больший интерес к еде, отмечено повышение физической активности животных. Однако у некоторых из них все еще сохранялись признаки тяжелого патологического состояния. Повышение абсолютного количества лейкоцитов в крови крыс этой группы зафиксировано до 7,7*10*9/л. Как видно на рис.8, замыкающая пластинка выполненного раннее дефекта разрушена с дистального края в маргинальной области. Межзубная перегородка дистальнее правого нижнего резца разрушена, имеет негомогенную структуру. В подчелюстном клетчаточном пространстве обнаружена инфильтрация диаметром 0,5х0,7 см, границы нечеткие. После вскрытия получен гнойный экссудат. Рентгенологическое исследование выявило деструкцию костной ткани в области препарированного сегмента (рис.8).

Рисунок 8 - Рентгенологический снимок челюстно-лицевой области крысы опытной группы, получавшей фармакологическую коррекцию бисфосфонатобусловленного остеомиелита производным тиодиазина с шифром TD-0352 в боковой проекции

Примечание: замыкающая пластинка выполненного раннее дефекта разрушена с дистального края в маргинальной области; межзубная перегородка дистальнее правого нижнего резца разрушена, имеет негомогенную структуру; в подчелюстном клетчаточном пространстве обнаружена инфильтрация диаметром 0,5х0,7 см, границы нечеткие; после вскрытия получен гнойный экссудат; рентгенологическое исследование выявило деструкцию костной ткани в области препарированного сегмента

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.11

Морфологические изменения кости проявлялись в ее некротическом набухании и образовании секвестров, у большинства животных кость легко соскабливалась острым инструментом. У животных этой группы был отёк мягких тканей, пальпация челюстно-лицевой области слабоболезненная.

В пятой группе, животные которой получали соединение из ряда дериватов тиенопиридина под шифром AZ-023, смертность составила 30% (3 животных из 10). В течение эксперимента животные были спокойны, проявляли умеренный интерес к еде, реагировали адекватно на внешние раздражители. Количество лейкоцитов в крови животных данной группе составило 7,2*10*9/л. Замыкающая пластинка выполненного раннее дефекта разрушена с дистального края в маргинальной области. Межзубная перегородка дистальнее правого нижнего резца разрушена, имеет негомогенную структуру. Резорбция участка верхушки альвеолярного гребня диаметром 0,7 х 0,7 мм. На рентгенологической картине выявляется очаг деструкции костной ткани в области препарированного сегмента (рис.9). Морфологические изменения кости проявлялись в её некротическом набухании, а также образовании секвестров. У одного животного из этой группы был обнаружен очаг инфильтрации мягких тканей, что также представлено на рис.9

Рисунок 9 - Рентгенологический снимок челюстно-лицевой области крысы опытной группы, получавшей фармакологическую коррекцию бисфосфонатобусловленного остеомиелита производным тиенопиридина с шифром AZ-023 в боковой проекции

Примечание: на рентгенологической картине выявляется очаг деструкции костной ткани в области препарированного сегмента; морфологические изменения кости проявлялись в её некротическом набухании, а также образовании секвестров; у одного животного из этой группы был обнаружен очаг инфильтрации мягких тканей

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.12

В шестой группе крыс, получавших производное цианотиоацетамида под шифром Mаr-075, летальность составила 30% (3 животных из 10). В ходе эксперимента по воссозданию медикаментозного остеомиелита животные вели себя не активно, особого интереса к воде и пище не проявляли. Ситуация стала диаметрально противоположной после начала введения нового производного 1,4-дигидропиридина: животные стали вести себя активнее, взаимодействовали друг с другом, адекватно реагировали на внешние раздражители. Отмечалось улучшение аппетита. На второй неделе введения препарата средний вес популяции увеличился на 2 грамма, что представлено в таблице 1, в то время как в остальных опытных группах вес продолжал снижаться. Абсолютное количество лейкоцитов в данной группе составило 6,8*10*9/л (табл.2). Рентгенологическое обследование показало деструкцию костной ткани в области препарированного сегмента. Замыкающая пластинка выполненного раннее дефекта разрушена с дистального края в маргинальной области. Межзубная перегородка дистальнее правого нижнего резца разрушена, имеет негомогенную структуру. Резорбция верхушки альвеолярного гребня диаметром 0,7х0,7 мм (рис.10). Морфологические изменения кости проявлялись в образовании секвестров, значительного увеличения объема костных тканей не выявлено. У животных этой группы был визуально отмечен минимальный отёк мягких тканей в сравнении с крысами всех опытных групп, пальпация челюстно-лицевой области у них была безболезненная.

Рисунок 10 - Рентгенологический снимок челюстно-лицевой области крысы опытной группы, получавшей фармакологическую коррекцию бисфосфонатобусловленного остеомиелита производным цианотиоацетамида с шифром Mar-075 в боковой проекции

Примечание: замыкающая пластинка выполненного раннее дефекта разрушена с дистального края в маргинальной области; межзубная перегородка дистальнее правого нижнего резца разрушена, имеет негомогенную структуру; резорбция верхушки альвеолярного гребня диаметром 0,7х0,7 мм; морфологические изменения кости проявлялись в образовании секвестров, значительного увеличения объема костных тканей не выявлено

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.13

Седьмая группа, животные которой получали препарат сравнения нимесулид, отличалась тяжелым течением заболевания, смертность в этой группе составила 70% (7 животных из 10). Животные были пассивны к внешним раздражителям, еде, практически не передвигались. Отмечался значительный отек мягких тканей, в том числе подчелюстного клетчаточного пространства (рис.11). В данной группе было определено наивысшее значение общего числа лейкоцитов, а именно 10,8*10*9/л, достоверно превышающее значение в контрольной группе. Межзубная перегородка дистальнее правого нижнего резца была разрушена, имела негомогенную структуру. Очаг резорбции верхушки альвеолярного гребня диаметром 0,5 х0,5 мм. На рентгенологической картине выявлены очаги деструкции костной ткани, распространившиеся за пределы препарированного сегмента (рис.12). Морфологически кость напоминала гумму, легко соскабливалась, была значительно увеличена в объеме, источала неприятный запах, что говорит о гнойных осложнениях медикаментозного остеомиелита.

Рисунок 11 - Участок нижней челюсти крысы группы сравнения с медикаментозным остеомиелитом и двухнедельной фармакотерапией нимесулидом

Примечание: гнойное воспаление мягких тканей свидетельствует о распространении патологии за пределы оперированного сегмента, снижении антигенных сил организма и возможности присоединения вторичной инфекции, источником которой может стать собственная микрофлора полости рта

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.14

Рисунок 12 - Рентгенологический снимок челюстно-лицевой области крысы опытной группы, получавшей фармакокоррекцию бисфосфонатобусловленного остеомиелита нимесулидом в боковой проекции

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.68.15

Таким образом, полученные нами результаты экспериментальных исследований на модели бисфосфонатобусловленного остеомиелита показали отчетливо выраженную противовоспалительную активность синтезированных нами новых производных цианотиоацетамиада. Все пять исследуемых образцов в 2-3 раза превосходили нимесулид по противовоспалительной эффективности, что выражалось в более низком проценте смертности экспериментальных животных и менее выраженной лейкоцитарной реакции. Рентгенографическое исследование нижней челюсти выявило способность новых гетероциклических соединений – дериватов дигидропиридина, тиодиазина и тиенопидина, применяемых в дозе 2,5 мг/кг внутрижелудочно на протяжении 2 недель, предотвращать появление очагов деструкции костной ткани при бисфосфонатобусловленном остеомиелите.

Наиболее выраженные противовоспалительные свойства на модели медикаментозного остеомиелита обнаружены у производных цианотиоацетамида под шифрами CV-131, TD-0331, AZ-023 и Mar-075.

Практически стопроцентная вероятность развития медикаментозного остеомиелита при хирургических вмешательствах на фоне приема бисфосфонатов, обнаруженная при моделировании патологического состояния, а также тяжесть течения данной патологии, высокая частота встречаемости гнойных осложнений должны обращать особое внимание практикующих стоматологов-хирургов и челюстно-лицевых хирургов на тщательный сбор анамнеза, применение профилактических и терапевтических подходов, которые могут улучшить результаты лечения пациентов, получающих бисфосфонаты.

В свою очередь, терапия экспериментального медикаментозного остеомиелита новыми производными цианотиоацетамида показала наличие у последних противовоспалительных свойств, превышающих таковые нимесулида. Данный результат свидетельствует о целесообразности дальнейшего экспериментального исследования новых производных цианотиоацетамида.