THE EFFECTIVENESS OF MEMBERS OF THE FAMILY BACILLACEAE AGAINST SOYBEAN FUNGAL PATHOGENS

Сою выращивают по всему миру, ведущими странами являются США, Аргентина, Бразилия, Индия. Мировое производство сои с каждым годом увеличивается

По результатам мониторинга, проведённого в 2023 г., и охватившего 64,6% посевной площади под соей, на 13,8% обследованных площадей были распространены заболевания, наиболее вредоносными из которых были грибные болезни: септориоз (возбудитель – Septoria glycines), аскохитоз (возбудитель – Ascochyta sojaecola), пероноспороз (возбудитель – Peronospora manshurica) и фузариоз (возбудители – комплекс грибов р. Fusarium), а также бактериоз

Несмотря на то, что основную долю рынка средств защиты растений от грибных болезней в России и за рубежом занимают химические фунгициды, в последние десятилетия во всём мире наблюдается устойчивая тенденция к внедрению в систему защитных мероприятий биофунгицидов, представляющих собой препараты на основе живых микроорганизмов и/или их метаболитов. Данные препараты являются относительно дешёвыми и (в отличие от химических фунгицидов) экологически безопасными. Однако широкое внедрение биофунгицидов тормозится нехваткой эффективных штаммов, особенно – адаптированных к почвенно-климатическим условиям конкретных регионов.

Текущий (на 18.09.2024 г.) перечень биологических препаратов, согласно Государственному каталогу пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, включает всего 9 фунгицидов на основе бактерий р. Bacillus, р. Pseudomonas и грибов р. Trichoderma. Данные препараты направлены на предотвращение развития таких болезней как церкоспороз, пероноспороз, фузариозные корневые гнили, фузариозное увядание, антракноз, аскохитоз, фузариоз, плесневение семян, альтернариоз при слабом развитии болезни

Цель исследования – изучить антибиотическую активность представителей семейства Bacillaceae в отношении актуальных для Красноярского края возбудителей грибных болезней сои.

В работе изучали антибиотическую активность 22 штаммов-антагонистов, выделенных из почв Красноярского края (Bacillus altitudinis, B. atrophaeus, B. cereus, B. megaterium, B. simplex, B. subtilis, Peribacillus simplex и Bacillus sp.) в отношении возбудителей грибных болезней сои. Один из штаммов (RSA 1 (B-13893) B. atrophaeus) ранее был запатентован авторами в качестве основы для биопрепарата против грибных болезней сои (Патент на изобретение RU 2791332 C1 07.03.2023), остальные штаммы на антагонизм против возбудителей болезней сои не тестировались. В качестве тест-культур использовали 2 изолята Alternaria sp. (Alt C20, Alt C24), 2 изолята Fusarium sp. (Fus C7, Fus C15) и 1 изолят Sclerotinia sclerotiorum (Scler C16). Идентификацию бактерий проводили методами MALDI-TOF масс-спектрометрии, по нуклеотидной последовательности гена 16SpРНК; идентификацию грибов проводили по характеру спороношения и совокупности других культурально-морфологических признаков.

Проверку антибиотического действия изучаемых штаммов на тест-культуры проводили стандартным методом двойных культур в чашках Петри

[6]

,

[7]

. Питательной средой служила среда №2 ГРМ ФБУН ГНЦ ПМБ половинной концентрации

[8]

, контролем служили чашки Петри с тест-культурами без антагонистов (рис. 1). Чашки с посевами инкубировали в течение 10 суток при температуре 25 ± 1 °C, после чего измеряли площадь колоний тест-культур в присутствии изучаемых штаммов и выражали её в % от контроля.

Рисунок 1 - Метод встречных культур на примере Alt C20:

1 – рост тест-культуры в контроле; 2 – рост тест-культуры в присутствии штамма СХ5

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.66.1

Измерение площади колоний проводили по фотографиям с помощью программы ImageJ. Для оценки статистической значимости и показателей силы влияния факторов «штамм-антагонист» и «тест-культура гриба» использовали двухфакторный дисперсионный анализ. После выполнения дисперсионного анализа проводили попарную оценку статистической значимости различий между индивидуальными средними с помощью тестов Шеффе и Тьюки

[9]

. Однотипность реакции тест-культур на набор изучаемых штаммов оценивали по коэффициенту корреляции Пирсона с последующим анализом корреляционной матрицы с помощью факторного анализа. В качестве программного обеспечения для дисперсионного, корреляционного и факторного анализа использовали StatSoft, Inc. (2007) STATISTICA version 8.0.

Зафиксированный в эксперименте антибиотический эффект штаммов-антагонистов варьировал от практически полного подавления роста тест-культуры до отсутствия антибиотического воздействия (табл. 1, рис. 2, 3).

Рисунок 2 - Пример зависимости антибиотического эффекта от штамма-антагониста при использовании одной и той же тест-культуры (Fus C15):

1 – штамм RSA9, подавление роста тест-культуры ярко выражено; 2 – штамм RSA4, подавление роста тест-культуры отсутствует

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.66.3

Рисунок 3 - Пример зависимости антибиотического эффекта от тест-культуры при использовании одного и того же штамма-антагониста (RSA2):

1 – тест-культура Alt C20, подавление роста тест-культуры ярко выражено; 2 – тест-культура Fus C15, подавление роста тест-культуры выражено слабо

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.66.4

Дисперсионный анализ показал статистически значимое влияние факторов «штамм-антагонист» (p<0,001, показатель силы влияния 57,33%) и «тест-культура гриба» (p<0,001, показатель силы влияния 15,87%), а также взаимодействия этих факторов (p<0,001, показатель силы влияния 26,16%) на подавление роста тест-культур.

В среднем по тест-культурам максимальный антибиотический эффект проявил штамм СХ6, минимальный – штамм RSA12 (рис. 4).

Рисунок 4 - Антибиотический эффект изучаемых штаммов в среднем по тест-культурам

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.66.5

В среднем по изучаемым штаммам максимальную чувствительность к их антибиотическому действию проявил изолят р. Alternaria Alt C24, минимальную – изолят р. Fusarium Fus C15 (рис. 5)

Рисунок 5 - Площадь колоний тест-культур в % к контролю в присутствии антагонистов с усреднением по штаммам

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.66.6

Результаты попарного сравнения тест-культур по средней чувствительности к набору изученных антагонистов представлены в таблицах 2 и 3.

Между тест-культурами выявлены статистически значимые положительные корреляции по чувствительности к изучаемым штаммам-антагонистам. Особенно высокая корреляция (r= 0,832) наблюдалась между Fus C7 и Fus C15. В то же время чувствительность Scler C16 к изучаемым штаммам относительно слабо коррелировала с чувствительностью Alt C20 и Alt C24, и практически не коррелировала с чувствительностью Fus C7 и Fus C15 (табл. 4).

Факторный анализ показал, что наблюдаемое (см. табл. 1) варьирование тест-культур по чувствительности к антибиотическому действию изучаемых штаммов на 87,8% определяется действием двух главных факторов (рис. 6, табл. 5).

Рисунок 6 - Диаграмма величин собственных значений матрицы коэффициентов корреляции, представленной в таблице 4

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.66.10

Результаты факторного анализа можно интерпретировать как наличие у изучаемых штаммов как минимум двух антибиотических соединений, различающихся спектром антифунгального действия. Первое соединение (Фактор 1) активно в отношении Alt C20, Alt C24, Fus C7 и Fus C15, второе соединение (Фактор 2) активно в отношении Scler C16. При этом ни один из изученных штаммов-антагонистов не оказался максимально эффективным одновременно по обоим факторам (рис. 7). Это ведёт к необходимости при разработке биопрепаратов для борьбы с возбудителями грибных болезней сои использовать комплексные препараты на основе нескольких штаммов-антагонистов, различающихся по спектру антифунгального действия. Данный вывод хорошо согласуется с результатами ранее проведённых нами аналогичных исследований, в которых изучали антибиотическую активность штаммов-антагонистов сем. Bacillaceae в отношении возбудителей грибных болезней рапса

[10]

.

Рисунок 7 - Проекция штаммов-антагонистов на оси, представляющие Фактор 1 и Фактор 2

Примечание: см. табл. 5, без вращения

DOI:10.60797/IRJ.2025.153.66.12

Проверка антибиотической активности 22 штаммов Bacillus altitudinis, B. atrophaeus, B. cereus, B. megaterium, B. simplex, B. subtilis, Peribacillus simplex и Bacillus sp., выделенных из почв Красноярского края, в отношении актуальных для региона возбудителей грибных болезней сои р.р. Alternaria и Fusarium, а также Sclerotinia sclerotiorum, показала, что эта активность статистически значимо зависит как от штамма бактерий, так и от таксономического положения возбудителя. В среднем по штаммам-антагонистам максимальную чувствительность к их антибиотическому действию проявил изолят Sclerotinia sclerotiorum, минимальную – представители р. Fusarium. Среди штаммов-антагонистов максимальную антифунгальную активность в среднем по изолятам фитопатогенных грибов проявил штамм Bacillus atrophaeus СХ6. В то же время спектр чувствительности фитопатогенных грибов к штаммам-антагонистам, равно как и спектр антифунгальной активности антагонистов, различается. Это подтверждается наличием статистически значимого эффекта взаимодействия факторов «штамм-антагонист» и «тест-культура гриба». Корреляционный анализ с последующим факторным анализом матрицы корреляций показал, что изучаемые штаммы продуцируют как минимум два антигрибных антибиотика, различающихся спектром действия. При этом интенсивность продуцирования этих антибиотиков у разных штаммов различается. В этой связи для защиты сои от грибных болезней необходимо использовать комбинации штаммов, различающихся по спектру антифунгальной активности. На основании результатов нашего исследования, для почвенно-климатических условий Красноярского края можно рекомендовать комбинацию штаммов Bacillus atrophaeus СХ6 и Pa2 Bacillus sp.