A Study of Hepatotoxicity of New Cyanothioacetamide Derivatives in a Chronic Experiment

В настоящее время проблема рациональной и эффективной фармакокоррекции болевого синдрома характеризуется высокой актуальностью. НПВП применяют при болевом синдроме различной этиологии, воспалительных реакциях и лихорадке (заболеваниях костно-мышечной системы и суставов, послеоперационных болях, головных болях напряжения, мигрени, дисменорее, почечной и печеночной коликах, синдроме хронической боли, простудных заболеваниях и т.д.). Применение населением НПВС проявляет тенденцию к возрастанию. Так, в Великобритании зарегистрировано около 15 млн. назначений НПВС в год, а в США ежегодно назначается и выписывается 111 млн. рецептов на НПВП. Приблизительно 36 млн. человек принимают безрецептурные лекарственные средства данной группы

Значительное количество современных болеутоляющих средств обладает широким спектром побочных эффектов, противопоказаний и лекарственных взаимодействий, что делает их практическое применение затруднительным. Наличие неблагоприятных эффектов при их применении обуславливает необходимость поиска высокоэффективных и безопасных лекарственных средств с выраженными анальгетическими свойствами.

НПВС на протяжении последних десятилетий являются самой назначаемой группой лекарственных средств в мире. Кеторолак, диклофенак, ибупрофен, индометацин, парацетамол, кислота ацетилсалициловая, нимесулид и другие высокоэффективные лекарственные средства имеют многочисленный спектр неблагоприятных реакций, включающий ульцерогенность, гепатотоксичность, нефротоксичность, гематотоксичность, нейротоксичность, кардиотоксичность и другие. Из представленных на фармацевтическом рынке ненаркотических анальгетиков-антипиретиков у кеторолака отмечается высокая степень ульцерогенности, у ацетаминофена (парацетамола) явно выраженная дозозависимая гепатотоксичность, у метамизола натрия – гематотоксичность и нейротоксичность, у кислоты ацетилсалициловой и индометацина – нефротоксичность, согласно

Значительный интерес для современных научных исследований представляют новые гетероциклические соединения из ряда производных цианотиоацетамида

В этой связи осуществлен предварительный отбор из 340 синтезированных нами на базе НИЛ «ХимЭкс» ЛГУ им. Владимира Даля новых производных цианотиоацетамида при помощи программного обеспечения виртуального биоскрининга Swiss Target Prediction

Результаты ранее проведенных исследований в тесте орофациальной тригеминальной боли показали, что соединения с лабораторными шифрами d02-141 и d02-154 на 10-й минуте наблюдений проявили анальгетическую активность в 1,8…1,9 раза более высокую, чем у метамизола натрия. Животные, получавшие образцы d02-123 и d02-149, демонстрируют возрастание анальгетической активности в 3,5 и 3,2 раза на 10-й и 15-й минутах наблюдения. Внутригастральное введение соединения d02-139 способствует уменьшению количества чесательных движений в 7,9 раза через 10 минут. Введение соединений с лабораторными шифрами d02-133 и d02-172 характеризовалось резким 10- и 20-ти кратным снижением количества чесательных движений на ранних сроках моделируемого острого болевого синдрома инъекцией формалина в область вибрисс, что превышает данные показатели у метамизола натрия в 9,8 и 21,4 раза соответственно, согласно

Исследования острой пероральной токсичности показали перспективность производных цианотиоацетамида для дальнейшей их разработки

Для оценки их возможного гепатотоксического действия, актуальным с нашей точки зрения было изучение влияния часто применяемых в клинической практике НПВС и синтезированных новых гетероциклических соединений с анальгетической активностью на фунциональное состояние печени в хроническом эксперименте.

Эксперимент реализован на 80 белых беспородных крысах-самцах массой 220…250г, полученных из вивария ФГБОУ ВО «Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки» МЗ РФ, в осенне-зимний период в лаборатории кафедры фундаментальной и клинической фармакологии с естественным режимом освещения. Крысы распределялись на интактную и 9 экспериментальных групп по 8 особей: животные первых четырех (референтные) получали индометацин в дозе 7 мг/кг, нимесулид в дозе 5 мг/кг, кислоту ацетилсалициловую и парацетамол в дозе 50 мг/кг однократно в сутки на протяжении 14 дней. Оставшиеся пять групп (опытные) включали животных, которым через желудочный зонд в виде водной взвеси вводили оригинальные синтезированные производные цианотиоацетамида с наиболее выраженной анальгетической активностью по результатам проведенных ранее экспериментов in vivo. Дизайн составлен в соответствии с руководством по доклиническим исследованиям

[16]

. Их структура и химическое строение представлены ниже на рисунках 1-5.

Рисунок 1 - d02-123: 5-cyano-N-(2,4-dichlorophenyl)-4-(2-furyl)-2-methyl-6-[(2-oxo-2-{[3-(trifluoromethyl)phenyl]amino}ethyl)thio]-1,4-dihydropyridine-3-carboxamide

DOI:10.23670/IRJ.2024.140.69.1

Рисунок 2 - d02-133: 5-cyano-N-(2,4-dichlorophenyl)-4-(2-furyl)-2-methyl-6-({2-[(3-methylphenyl)amino]-2-oxoethyl}thio)-1,4-dihydropyridine-3-carboxamide

DOI:10.23670/IRJ.2024.140.69.2

Рисунок 3 - d02-139: 5-cyano-N-(2,4-dichlorophenyl)-4-(2-furyl)-6-({2-[(4-methoxyphenyl)amino]-2-oxoethyl}thio)-2-methyl-1,4-dihydropyridine-3-carboxamide

DOI:10.23670/IRJ.2024.140.69.3

Рисунок 4 - d02-172:5-cyano-N-(2,4-dichlorophenyl)-6-({2-[(2-ethoxyphenyl)amino]-2-oxoethyl}thio)-4-(2-furyl)-2-methyl-1,4-dihydropyridine-3-carboxamide

DOI:10.23670/IRJ.2024.140.69.4

Рисунок 5 - d02-149:6-[(2-anilino-2-oxoethyl)thio]-5-cyano-N-(2,4-dichlorophenyl)-4-(2-furyl)-2-methyl-1,4-dihydropyridine-3-carboxamide

DOI:10.23670/IRJ.2024.140.69.5

В экспериментах задействованы группы из 8 животных. Исследуемые новые гетероциклические соединения вводили в соответствующих группах внутрижелудочно, в дозе 5 мг/кг однократно в день, в течение 14-х суток крысам, лишенным пищи за 16 часов до опыта. Забой осуществлялся на 15-й день.

За животными всех групп осуществлялся визуальный мониторинг поведенческой активности, аппетита, жажды, состояния шерстного покрова. После окончания эксперимента производился забор крови из бедренной вены. Стандартными методиками (кинетическими колориметрическими) на спектрофотометре SOLAR PM 2111 определяли уровень общего билирубина и щелочной фосфатазы, а также активность аланинаминотрансферазы в крови животных всех групп.

Экспериментальные исследования осуществлялись в полном соответствии с приказом №199н Минздрава России от 1 апреля 2016 года (Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики) НЗ. На всем протяжении периода исследований лабораторные животные были под наблюдением в условиях свободного доступа к пище и воде, в соответствии с ГОСТ 33044–2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (утвержден приказом Федерального агентства по техрегулированию и метрологии №1700-ст, от 20 ноября 2014 г.).

Исследования получили одобрение комиссии по биоэтике ФГБОУ ВО «Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки», Министерства здравоохранения РФ (Луганск, кв. 50-летия Обороны Луганска, 1Г), протокол №6 от 01.11.2021 г.

При обработке и анализе полученных экспериментальных данных проверялась нормальность их распределения по критерию Шапиро-Уилка, так как в большинстве случаев количество замеров n < 50.

Если данные по группам не имели нормального распределения, то последующий статистический анализ осуществлялся методами непараметрической статистики

Данный подход позволяет обнаружить существенные различия в группах, когда t-критерий Стьюдента их не выявляет при распределениях, далеких от нормального.

Полученные в эксперименте данные биохимических исследований по уровню общего билирубина в крови крыс представлены в таблице 1. При сравнении средних значений этого показателя у животных референтных групп с таковыми у интактных крыс установлены наиболее выраженные изменения в группах, где вводили парацетамол и нимесулид. 

Из табл. 1 следует, что введение нимесулида в эксперименте по изучению хронической гепатотоксичности привело к увеличению уровня билирубина на 35% в сравнении с нормальными его значениями у интактных крыс.

Анализируя исследуемый биохимический маркер функционального состояния печени в крови животных опытных групп, получавших различные оригинальные дериваты цианотиоацетамида, не были зарегистрированы изменения концентрации общего билирубина у крыс, получавших на протяжении 14 суток соединения с лабораторными шифрами d02-123 и d02-139.

Апостериорный тест Данна с использованием поправки Бонферрони (0,001111) показал, что средние ранги следующих пар различаются (где p < α, при α = 0,05). Чем меньше значение р, тем больше различие между соответствующими соединениями (табл. 2). Минимальные отличия от исходных значений (у интактных крыс) зафиксированы для крыс опытных групп d02-123 и d02-139.

Наиболее выраженное влияние на уровень общего билирубина оказал новый образец - гетероциклическое соединение с шифром d02-149, поскольку его хроническое действие привело к достоверному увеличению концентрации исследуемого биохимического маркера на 48% (табл. 1) в сравнении со значениями у интактных животных (табл. 2).

Полученные результаты биохимических исследований, отражающие функционирование органа детоксикации, также свидетельствуют о том, что в крови крыс после двухнедельного введения соединения с лабораторным шифром d02-172 увеличивается уровень общего билирубина на 21% в сравнении с показателями в интактной группе.

Животные, получавшие в эксперименте соединение с шифром d02-133 не имели достоверных различий с таковыми у интактных крыс по уровню общего билирубина в крови.

Исходя из по полученных показателей общего билирубина крови видно, что у животных двух экспериментальных групп, получавших различные образцы производных цианотиоацетамида с шифрами d02-123 и d02-139, не обнаружены признаки возрастания концентрации этого показателя в хроническом эксперименте.

Еще одним маркером функционального состояния печени является щелочная фосфатаза, активность которой у крыс референтных групп различна, что видно из данных, приведенных в табл. 3. Так, крысы после двухнедельного введения парацетамола характеризовались повышением активности щелочной фосфатазы на 39% в сравнении с таковой, зарегистрированной у животных интактной группы. После соответствующего введения нимесулида зафиксировано возрастание активности этого печеночного маркера в биохимическом анализе крови крыс на 44,2% от нормальных значений.

Наиболее выраженное влияние на активность щелочной фосфатазы установлено при введении по дизайну эксперимента новых соединений с шифрами d02-149 и d02-133, поскольку их хроническое воздействие привело к возрастанию на 36% и 37% активности исследуемого биохимического маркера в сравнении с интактными значениями, соответственно (табл. 3).

Апостериорный тест Данна с использованием поправки Бонферрони (0,001111) показал, что средние ранги следующих пар различаются (где p < α, при α = 0,05), табл. 4.

Полученные результаты биохимических исследований, отражающие функционирование органа детоксикации, также свидетельствуют о том, что в крови крыс после двухнедельного введения соединения с лабораторным шифром d02-139 увеличивается уровень щелочной фосфатазы на 32% в сравнении с показателями в интактной группе.

Исходя из табл. 3 и табл. 4, после 14-дневного внутрижелудочного введения новых производных цианотиоацетамида с высокой анальгетической активностью животным опытных групп с лабораторными шифрами d02172 и d02-123, не зарегистрированы отличия активности щелочной фосфатазы в сравнении с таковыми у крыс интактной группы.

Активность изучаемой трансаминазы в крови животных после приема парацетамола в сравнении с интактными крысами возросла на 30%. После двухнедельного введения нимесулида активность аланинаминотрансферазы увеличилась на 35% в сравнении со значениями этого показателя у крыс интактной группы (табл. 5). 

Наиболее выраженное влияние на уровень аланинаминотрансферазы оказал новый образец - гетероциклическое соединение с шифром d02-149, поскольку его хроническое действие привело увеличению показателя на 31% в сравнении с интактными значениями.

Крысы опытных групп, получавшие в эксперименте соединения с лабораторными шифрами d02-123 и d02-139, не имели достоверных различий с таковыми у интактных крыс по уровню аланинаминотрансферазы в крови.

На протяжении проводимого эксперимента по изучению хронической гепатотоксичности изучаемых новых дериватов цианотиоацетамида нами не зафиксированы признаки интоксикации. Аппетит животных был сохраненным, двигательная активность в норме, агрессивности и конфликтности не отмечено.

Исходя из полученных в опытах in vivo биохимических показателей крови животных, характеризующих состояние гепатоцитов, можно сделать вывод, что наиболее благоприятным для функционирования печени следует считать хроническое воздействие изучаемого производного цианотиоацетамида с шифром d02-123. Идентичные нормальным физиологическим значениям уровни общего билирубина, активности аланинаминотрансферазы и щелочной фосфатазы после двухнедельного его введения в эффективных для анальгезии дозах свидетельствуют о сохранении целостности клеточных мембран гепатоцитов и отсутствии гепатотоксичности.

Таким образом, исследуемые пять новых оригинальных производных цианотиоацетамида с выраженными антиноцицептивными свойствами, вводимые ежедневно внутригастрально в течение 14 суток в дозе 5 мг/кг, позволили выделить самое перспективное производное цианотиоацетамида, наиболее безопасное в плане гепатотоксичности – гетероциклическое соединение с лабораторным шифром d02-123.

Анализируя результаты проведенных экспериментальных исследований крови крыс, получавших новое производное цианотиацетамида с лабораторным шифром d02-123 (5-cyano-N-(2,4-dichlorophenyl)-4-(2-furyl)-2-methyl-6-[(2-oxo-2-{[3-(trifluoromethyl)phenyl]amino}ethyl)thio]-1,4-dihydropyridine-3-carboxamide), следует отметить, что уровень общего билирубина и щелочной фосфатазы в эксперименте исследования их хронической токсичности был на уровне нормальных значений и соответствовал уровню у интактных животных.

Таким образом, из исследуемых пяти новых оригинальных производных цианотиоацетамида с выраженными болеутоляющими свойствами, вводимых ежедневно внутригастрально в течение 14 суток в дозе 5 мг/кг, наиболее безопасным в плане воздействия на функционирование печени является соединение с лабораторным шифром d02-123.

Биохимический анализ крови крыс, получавших новые производные цианотиоацетамида с анальгетической активностью на протяжении 2 недель с шифром d02-149, свидетельствует о его гепатоксичности. Полученные данные представляют практический интерес в контексте доклинических исследований новых высокоэффективных и безопасных лекарственных средств.