New organizational approaches of cord blood unit processing taking into account NK-cell characteristics for the purposes of adoptive immunotherapy

В случаях резистентности к традиционным схемам терапии, врачи-гематологи рассматривают возможность применения более интенсивных подходов. Эти методы могут включать: высокодозную химиотерапию; таргетную терапию; иммунотерапию; трансплантацию костного мозга или аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ГСК). Выбор конкретного метода лечения зависит от индивидуальных особенностей пациента, типа лейкемии, стадии заболевания и предыдущего опыта лечения. Эффективность трансплантаций обусловлена двумя основными факторами: применением высоких доз химиотерапии и эффектом аллогенной реакции «трансплантат против лейкемии», который осуществляется донорскими лимфоцитами. Только около одной трети пациентов, нуждающихся в алло-ГСК, имеют подходящего родственного донора. Пуповинная кровь (ПК) служит альтернативным источником ГСК. Преимущества ПК включают быструю доступность и менее строгие требования к соответствию по системе лейкоцитарных антигенов, что позволяет подобрать единицы ПК для большинства пациентов. Кроме того, ПК имеет низкий риск передачи инфекции от донора к реципиенту

Цель исследования: изучение организации процессинга пуповинной крови с учетом количественных и качественных показателей лейкоцитарного концентрата пуповинной крови, включая иммунофенотипическую характеристику NK-лимфоцитов, с анализом их KIR–рецепторов для адоптивной иммунотерапии.

Исследование проведено на базе публичного банка пуповинной крови государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Самарский областной медицинский центр Династия». Для исследования использовалась ПК 1583 доношенных новорожденных, собранная после получения добровольного информированного согласия (утверждённого этическим комитетом) матери при физиологических родах, при этом не было выявлено противопоказаний. Срок гестации детей составил 37–41 недель (40,2+1,2 недели). В третьем периоде родов после рождения ребенка пуповину пережимали и пересекали, затем пунктировали пуповинную вену системой для забора донорской крови, которая содержала антикоагулянт CPDA 35,5 мл. Полученный материал доставлялся в термоконтейнере при комнатной температуре и анализировался не позднее чем через 24 часа после процедуры. В соответствии с действующим Российским законодательством, международным стандартом NETCORD и Российским стандартом РУСКОРД, все образцы ПК, поступившие в лабораторию центра, анализировались для оценки пригодности для аллогенной трансплантации ГСК. В рамках стандартной процедуры проводился установленным критериям отбор ПК:

-лейкоциты - не менее 15x108 в объеме заготовленного образца ПК с антикоагулянтом;

- объем не менее 120 мл с учетом антикоагулянта;

- отрицательные результаты тестов на инфекции.

Отобранные образцы подвергались дальнейшему HLA-типированию по локусам A, B, C, DRB1 и DQA1. Образцы, не соответствующие критериям, исключались из дальнейшего процессинга. Каждая единица ПК подвергалась процессингу: выделению концентрата ГСК. Для уменьшения общего объема крови и удаления эритроцитов использовался 10% гидроксиэтилкрахмал и метод двойного центрифугирования. В результате выделения концентрата ГСК первоначальный объем собранного образца (120,2 +35,3 мл) уменьшился до 25 мл. Для криоконсервации использовались контейнеры MacoBiotec (Франция). После добавления ДМСО в финальной концентрации 10% образец ГСК ПК подвергался криоконсервации с замораживанием в автоматизированном комплексе Биоархив в течение 30 минут, при снижении температуры на 1–3°C в минуту. Дальнейшее хранение концентрата ГСК проводилось в парах жидкого азота. Количественная характеристика ПК оценивалась с использованием гематологического анализатора Mindray BC 5300 по 26 параметрам. Качественная идентификация специфических рецепторов, экспрессирующихся на поверхности лейкоцитарных и гемопоэтических стволовых клеток ПК, проводилась после процессинга, то есть получения концентрата ГСК методом проточной цитометрии (цитофлуориметр BDFACS Canto™ II (США), применялась панель антител, включающая следующие кластеры дифференцировки (CD): CD4, CD19, CD34, CD3, CD8, CD56+ и CD16.

С 2023 года в работу банка ПК был внедрен дополнительный анализ единиц ГСК ПК на KIR-иммуноглобулиновые рецепторы на лимфоцитах, проведен анализ 255 образцов ПК на 16 KIR-генов. Для идентификации генов KIR применялся метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров, а для визуализации – агарозные гели от ДНК-Технологии и система документирования DigiDoc-IT от UVP (Германия).

Статистический анализ выполнен в программе Statistica версии 7, результаты анализа клеточного состава единиц ПК представлены в виде среднего значения, стандартной ошибки среднего. При работе с качественными признаками использовали тест хи-квадрат Пирсона с поправкой на непрерывность. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.

Анализ процессинга 1583 единиц ПК позволил получить следующие данные. В результате процедуры выделения лейкоконцентрата при седиментации эритроцитов с использованием гидроксиэтилкрахмала наблюдается значительное увеличение доли лимфоцитов с 31,9% до 35,6% (p=0,067). При этом доля эозинофилов и базофилов уменьшается почти вдвое: с 5,0% до 2,9% и с 1,9% до 1,0% (p=0,03), соответственно, в то время как доля нейтрофилов остается практически неизменной (47,2% до и 47,0%, p=0,07), после выделения концентрата. Также отмечается уменьшение количества эритроцитов на 85%, при этом сохраняется 91% лейкоцитов и 70% тромбоцитов в клеточном концентрате после обработки. После обработки в итоговом криомешке объемом 25 мл были зафиксированы следующие показатели: общее количество лейкоцитов достигло 17,41±0,4x108, число лимфоцитов с маркером CD34+ составило 5,25±0,6x106, а натуральных киллеров (CD3-CD16+CD56+) – 1,65±0,7x108.

Одной из ключевых характеристик единицы ПК является количество NK-клеток (CD3- CD16+ CD56+), которое составляет 1,65 ± 0,7 x 108 или 25,9 % от всех лимфоцитов. При анализе популяций CD45+CD3+ лимфоидных клеток была выявлена популяция NKT-клеток с иммунофенотипом CD3+CD16/CD56+, составившая 6,22% антиген-положительных клеток от всех лимфоцитов. Анализ гетерогенности NK-лимфоцитов и NKT–лимфоцитов концентрата пуповинной крови представлен в таблице 1.

Анализ генетического профиля KIR-рецепторов лимфоцитов продемонстрировал 100% присутствие структурных ингибирующих генов KIR2DL4, KIR3DL2, KIR3DL3, а также псевдогенов KIR2DP1 и KIR3DP1 во всех исследованных образцах. Примечательно, что в изученной популяции наблюдалось преобладание ингибирующих KIR-генов над активирующими, при этом ген KIR2DS4 являлся исключением из этой тенденции. Наиболее распространенными ингибирующими KIR-генами оказались KIR2DL1 и KIR3DL2 (98,6% каждый), KIR2DL3 (95,5%), а также KIR2DL5 (46,5%) и KIR2DL2 (34,5%). Среди активирующих рецепторов доминировал ген KIR2DS4 (89,4%), в то время как остальные активирующие гены встречались реже.

Проведен анализ распределения HLA и KIR-генотипов среди единиц ПК, установлено, что 3,5% единиц ПК имеют наиболее благоприятный статус «best», 20,4% отнесены к категории «better», в то время как преобладающее большинство (76,1%) попало в нейтральную группу «neutral».

Полученные результаты вносят важный вклад в понимание распределения различных субпопуляций NKT-клеток и генетического профиля KIR-рецепторов в исследуемой популяции.

Содержание лейкоцитов и ГСК – ключевой параметр единицы ПК для поиска в международных донорских базах HLA-совместимого донора реципиентам. Высокая концентрация этих клеток увеличивает шансы на успешный подбор образца для трансплантации. Самарский банк ПК утилизирует образцы, содержащие менее 15x10^8 лейкоцитов в исходном объеме до обработки антикоагулянтом. Долгосрочному криохранению подвергаются только концентраты с высокой клеточностью: не менее 1,0x108 CD34+ клеток. Средние показатели в концентрате ГСК ПК составляют 5,3±0,6x106 CD34+ клеток и 17,41±0,4x108 лейкоцитов на образец.

Наши данные по общему количеству лейкоцитов в единице ПК (72,57±0,56x109/л) существенно превышают показатели Банка стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы (39,00±0,48x109/л)

Иммунологический профиль концентрата ГСК ПК, выявленный в нашем исследовании, соответствует данным Румянцева С.А.

Разработанная методика выявления оптимального генотипа направлена на снижение риска рецидивов и улучшение показателей выживаемости пациентов

В данном исследовании представлены новые организационные подходы процессинга единиц ПК: необходимо заготовлять образцы с высоким содержанием как, лейкоцитов, так и с высоким содержанием стволовых CD34+ и NK клеток (CD3-CD16+ CD56+) с характеризацией не только по HLA, но и по KIR-генотипу. При анализе процессинга образцов ПК были установлены следующие критерии обработки: если концентрация лейкоцитов до обработки с антикоагулянтом превышает 15x108 на единицу объема, то в 25 мл концентрата ГСК ПК, предназначенного для длительного криохранения, в среднем содержится: лейкоциты: 17,41+0,4x108; ГСК с маркером CD34+: 5,25+0,6x106; натуральные киллеры (CD3-CD16+CD56+): 1,65+0,7x108.

Наши результаты указывают на региональные особенности распределения KIR-генотипов и подчеркивают важность проведения локальных исследований для более точной оценки генетического профиля населения в контексте трансплантологии и лечения лейкозов, а также создают перспективы для оптимизации процедур отбора образцов ПК. Эти усовершенствования особенно важны при подготовке к трансплантациям, направленным на лечение злокачественных новообразований кроветворной системы и адоптивной иммунотерапии.