ANTIOXIDANTS OF THE LEAVES OF AMELANCHIER ROTUNDIFOLIA

АНТИОКСИДАНТЫ ЛИСТЬЕВ ИРГИ КРУГЛОЛИСТНОЙ

Научная статья

Тихомирова Т.И.¹, Андреева О.А.², Червонная Н.М.³, Аджиахметова С.Л.^4, *, Лигай Л.В.⁵

³ ORCID: 0000-0001-9685-1384;

⁴ ORCID: 0000-0001-9685-1384;

⁵ORCID: 0000-0001-7754-8793;

^{1, 2, 3, 4, 5} Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ВолгГМУ, Пятигорск, Россия

* Корреспондирующий автор (similla503[at]mail.ru)

Аннотация

Проведено сравнительное изучение весенних и осенних листьев ирги круглолистной (Amelanchier rotundifolia) на общее количество антиоксидантов, в том числе фенольных соединений и флавоноидов. Содержание антиоксидантов определяли амперометрическим методом на жидкостном хроматографе «Цвет Яуза-01-АА». Общее содержание фенольных соединений устанавливали с использованием реактива Фолина-Чокальтеу, содержание флавоноидов методом дифференциальной спектрофотомерии. Установлено, что оптимальным экстрагентом для извлечения всех антиоксидантов из анализируемого сырья является спирт этиловый 50%. Наибольшее количество антиоксидантов, фенольных соединений и флавоноидов накапливается в весенних листьях. Причём наблюдается чёткая корреляция между общим содержанием антиоксидантов, фенолов и флавоноидов.

Ключевые слова: ирга круглолистная, листья осенние, листья осенние антиоксидантная активность, фенольные соединения, флавоноиды.

ANTIOXIDANTS OF THE LEAVES OF AMELANCHIER ROTUNDIFOLIA

Research article

Tikhomirova T.I.¹, Andreeva O.A.², Chervonnaya N.M.³, Adzhiakhmetova S.L.^4, *, Ligay L.V.⁵

³ ORCID: 0000-0001-9685-1384;

⁴ ORCID: 0000-0001-9685-1384;

⁵ORCID: 0000-0001-7754-8793;

^{1, 2, 3, 4, 5} Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, branch of the Volgograd State Medical University, Pyatigorsk, Russia

* Corresponding author (similla503[at]mail.ru)

Abstract

The article features a comparative study of the spring and autumn leaves of Amelanchier rotundifolia for the total amount of antioxidants, including phenolic compounds and flavonoids. The content of antioxidants was determined by the amperometric method on a liquid chromatograph "Tsvet Yauza-01-AA". The total content of phenolic compounds was determined using the Folin-Chocalteu reagent, while the content of flavonoids was determined via differential spectrophotometry. It was found that the optimal extractant for extracting all antioxidants from the analyzed raw materials is ethyl alcohol, 50%. The greatest amount of antioxidants, phenolic compounds, and flavonoids accumulates in spring leaves. Moreover, there is a clear correlation between the total content of antioxidants, phenols, and flavonoids.

Keywords: Amelanchier rotundifolia, autumn leaves, autumn leaves antioxidant activity, phenolic compounds, flavonoids.

Введение

Плодовые культуры играют важную роль в жизни людей. Среди них много тех, которые выращиваются в большей степени для декоративных целей и часто называются “второстепенными” культурами, хотя имеют достаточно вкусные съедобные плоды и широко применяются в народной медицине при лечении ряда заболеваний. К таким растениям относится ирга (Amelanchier), которая относится к семейству розоцветные (Rosaceae), трибы яблоневые (Maleae). К настоящему времени известны несколько десятков видов ирги, произрастающих как в дикой природе, так и введённых в культуру [1], [2].

Наше внимание привлекла ирга круглолистная (Amelanchier rotundifolia), которая представляет декоративный листопадный кустарник высотой до 2,5 – 3,0 метров. Родиной её считается Малая Азия, но она широко распространена на Северном Кавказе. В настоящее время, в основном в кулинарии, применяются плоды ирги. Они имеют шарообразную форму и диаметр до 7 – 8 мм, черно-фиолетовый цвет и сладковатый вкус. В народной медицине применяют все части растения, в том числе и листья. Считается, что настой из листьев помогает при гипертонии, бессоннице, сердечно-сосудистых заболеваниях, а чай обладает обволакивающим и вяжущим свойствам [3].

Объяснить такое лечебное свойство листьев можно в первую очередь содержанием в них антиоксидантов и, прежде всего, фенольных соединений.

Целью работы явилось изучение листьев ирги круглолистных на наличие в них фенольных соединений и определение их количественного содержания.

Материалы и методы

Сырьём для исследования явились листья ирги круглолистной собранные весной (в мае) и осенью (в октябре) 2020 года в ботаническом саду Пятигорского медико-фармацевтического института. Листья высушивали теневой сушкой до постоянной массы

Определение наличия в сырье фенольных соединений проводили с помощью качественных реакций в пробирках и методом бумажной хроматографии на бумаге марки FN 7.

Определение суммарного содержания антиоксидантов исследовали на жидкостном хроматографе «Цвет Яуза-01-АА» амперометрическим методом.

Используя градуировочный график зависимости выходного сигнала от концентрации кверцетина и галловой кислоты, измеряли массовую концентрацию антиоксидантов [4], [5, С. 10–14], [6, С.130–135].

Массовую концентрацию (мг/г) определяли по формуле 1:

    (1)

где: Х_г – массовая концентрация антиоксидантов, найденная по градуировочному графику, мг/л; V_n – объем анализируемого извлечения, мл; m_n – навеска анализируемого сырья, г; N – кратность разбавления анализируемого извлечения.

Общее содержание фенольных соединений устанавливали спектрофотометрически по продуктам их окисления с реактивом Фолина-Чокальтеу [7, С. 373-380], [8, С. 242-251].

Концентрацию фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту в анализируемом растворе определяли по градуировочному графику, а содержание в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье рассчитывали по формуле 2:

     (2)

где: C – концентрация фенольных соединений в исследуемом извлечении, найденная по градуировочному графику, г/100мл; a – навеска сырья, г; V_a – объем аликвоты, мл; W₁, W₂ – объемы мерных колб, мл; W – потеря в массе при высушивании, % [9, С. 152-178], [10, С. 15-22], [11, С. 225-232].

Сумму флавоноидов так же определяли спектрофотометрическим методом с использованием прибора спектрофотометр СФ-102. Расчёт их содержания проводили в пересчете на кверцетин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х₁) по формуле 3:

    (3)

где: А – оптическая плотность исследуемого раствора;  – удельный показатель поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом при длине волны 408-415нм, равный 248; a – навеска сырья, г; W – влажность сырья, % [12].

Результаты и обсуждения

Качественные реакции, позволяющие установить в сырье наличие фенольных соединений, проводили как с осенними, так и с весенними листьями. Использовали порции сырья по 5 грамм. Часть порций экстрагировали водой дистиллированной, а часть 96%-ным этанолом в колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 45 минут. Извлечения сгущали до 1/3 объёма. С водными извлечениями проводили качественные пробирочные реакции. При добавлении нескольких капель 2%-ного водного раствора FeCI₃ наблюдали зелёную окраску. При добавлении 5%-ного водного раствора NaOH наблюдали ярко-жёлтую окраску. Оба результата могут быть следствием наличия в сыре фенольных соединений.

Спиртовые извлечения использовали для хроматографических исследований. В качестве элюирующих систем применяли системы: н- бутанол - кислота уксусная - вода (БУВ) с соотношении 4 : 1: 2 и кислота уксусная 15%. Хроматограммы просматривали в видимом и ультрафиолетовом свете, до и после обработки хромогенными реагентами. Использовали пары аммиака, 5%-ный водный раствор гидроксида натрия, 5%-ный спиртовый раствор хлорида алюминия, водный раствор хлорида железа (III). Как в извлечениях, полученных из осенних листьев, так и в извлечениях из весенних листьев, после обработки хроматограмм водным раствором хлорида железа (III), наблюдали по пять пятен, окрашенных в зелёный цвет. В УФ-свете эти пятна имели голубую, фиолетовую и темно-коричневую флюоресценцию. После обработки вышеописанными реактивами окраска пятен менялась: от паров NH₃ пятна становились ярко голубыми и жёлто-зелёными; от растворов NaOH и AICI₃ в видимом свете – приобретали желтовато-зеленую окраску, а в УФ-свете жёлто-зелёную флюоресценцию. Такое поведение веществ на хроматограммах может подтверждать их фенольную природу.

Для определения суммарного содержания антиоксидантов, суммы фенольных соединений методом Фолина-Чокальтеу, суммы антиоксидантов и суммы флавоноидов в извлечениях пробы сырья по 1 грамму трижды экстрагировали на водяной бане в колбе с обратным холодильником спиртом этиловым: 90%-ным, 70%-ным, 50%-ным и водой дистиллированной (очищенной). Объединённые водно-спиртовые и водные извлечения объединяли, фильтровали в колбы по 100 мл, отбирали пробы по 1мл и использовали для анализа.

Суммарное содержание антиоксидантов в исследуемых извлечениях

Содержание антиоксидантов в спиртовых, водно-спиртовых и водных извлечениях из листьев ирги в пересчете на кверцетин и галловую кислоту, площади пиков и кратность разбавления представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Содержание антиоксидантов (в пересчете на кверцетин и галловую кислоту) в извлечениях из ирги круглолистной

Название сырья	Используемые экстрагенты	Кратность разбавления	Содержание антиоксидантов, мг/г (n=6) в пересчете на
			кверцетин	галловую кислоту
Листья ирги, собранные осенью	спирт этиловый 90%	-	0,292±0,004	0,188±0,003
	спирт этиловый 70%	-	0,319±0,004	0,206±0,003
	спирт этиловый 50%	2	0,529±0,005	0,339±0,005
	вода очищенная	2	0,493±0,004	0,315±0,004
Листья ирги, собранные весной	спирт этиловый 90%	-	0,419±0,005	0,273±0,003
	спирт этиловый 70%	2	0,453±0,004	0,289±0,004
	спирт этиловый 50%	3	0,916±0,007	0,591±0,006
	вода очищенная	3	0,787±0,006	0,455±0,005

 

Амперометрическим методом установлено, что оптимальным экстрагентом суммы антиоксидантом из исследуемого сырья является спирт этиловый 50%, причём весенние листья по их содержанию значительно превосходят осенние листья.

Определение суммарного содержания фенольных соединений методом Фолина-Чокальтеу

Определение линейности методики и построение градуировочного графика [10, С. 15-22], [13] представлены в таблице 2 и на рисунке 1, содержание суммы фенольных соединений в извлечениях в таблице 3.

 

Таблица 2 – Оптическая плотность анализируемых растворов галловой кислоты с реактивом Фолина-Чокальтеу

Раствор, мкл	Концентрация галловой кислоты, г/100 мл	Оптическая плотность
25	0,00003	0,067
50	0,00006	0,126
75	0,00012	0,198
100	0,00018	0,318
125	0,00024	0,398
175	0,00036	0,641
200	0,00048	0,852

 

Визуальная оценка графика свидетельствует о его линейности, кроме того коэффициент корреляции составил 0,997, что позволяет использовать данный график для количественного определения фенольных соединений.

Рис. 1 – Градуировочный график взаимодействия кислоты галловой с реактивом Фолина-Чокальтеу

  Уравнение градиуровочного графика имеет вид: y = 1746x+0,004.  

Рис. 2 – УФ-спектр поглощения комплекса извлечений полученных экстракцией 90% спиртом этиловым (1), водой очищенной (2), 70% (3) и 50% (4) спиртом этиловым из листьев ирги, собранных весной, с реактивом Фолина-Чокальтеу

 

Таблица 3 – Содержание суммы фенольных соединений в извлечениях из листьев ирги, полученных экстракцией спиртом этиловым различной концентрации и водой очищенной

Используемые экстрагенты	Название сырья
	Листья ирги, собранные осенью		Листья ирги, собранные весной
	Соотношение пробы извлечения и реактива Фолина- Чокальтеу	Общее содержание фенолов	Соотношение пробы извлечения и реактива Фолина- Чокальтеу	Общее содержание фенолов
спирт этиловый 90%	1:2	3,277±0,0010	1:2	4,212±0,013
спирт этиловый 70%	1:2	3,581±0,0011	1:2	5,421±0,015
спирт этиловый 50%	1:2	4,868±0,013	1:2	7,568±0,015
вода очищенная	1:2	2,353±0,009	1:2	5,163±0,013

 

Из данных таблицы следует, что максимальное содержание суммы фенольных соединений наблюдается в извлечении из листьев ирги, собранных весной, полученном экстракцией 50% спиртом этиловым, и составляет 7,568±0,015%.

Количественное определение флавоноидов

Установлено, что комплексное соединение рутина и извлечений из листьев ирги, полученного экстракцией 50% и 70% спиртом этиловым, с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида, имеют максимальное поглощение при одной и той же длине волны 410±2 нм (рис. 3). Содержание суммы флавоноидов в извлечениях, полученных из листьев ирги представлено в таблице 4.

Рис. 3 – УФ-спектр поглощения комплекса 50% спиртового извлечения из листьев ирги круглолистной, собранных весной (А) и собранных осенью (Б), с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида

  Количественное определение флавоноидов проводили в 6 повторностях.  

Таблица 4 – Содержание суммы флавоноидов в извлечениях, полученных из листьев ирги

Используемые экстрагенты	Название сырья
	Листья ирги, собранные осенью		Листья ирги, собранные весной
	Время (мин) стабилизации оптической плотности	Содержание флавоноидов, % (n=6)	Время (мин) стабилизации оптической плотности	Содержание флавоноидов, % (n=6)
спирт этиловый 70%	40	1,457±0,006	40	2,279±0,008
спирт этиловый 50%	35	1,222±0,005	45	2,980±0,008

 

Анализ полученных результатов позволил установить, что спирт этиловый 50% является лучшим экстрагентом для извлечения суммы флавоноидов, чем наиболее часто используемый для получения этих веществ, спирт этиловый 70%. Наибольшее количество флавоноидов накапливается в листьях ирги весной и составляет 2,980±0,008%.

Заключение

В результате проведённых исследований установлено, что листья ирги круглолистной произрастающей в районе города Пятигорска содержат значительное количество антиоксидантов, в том числе фенольных соединений и флавоноидов. Выявлено соответствие между общим содержанием антиоксидантов, фенолов и флавоноидов наибольшее количество которых накапливается в листьях собранных весной. Оптимальным экстрагентом для выделения антиоксидантов является спирт этиловый 50%. 

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы

1. Ирга // Википедия. – [Электронный ресурс]. – URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Ирга (дата обращения: 12.11.2021)
2. Ирга: обзор ягодного кустарника и секреты его выращивания // Ferma.expert. – [Электронный ресурс]. – URL: https://ferma.expert/rasteniya/derevya/irga/irga (дата обращения: 12.11.2021)
3. Применяем листья ирги для лечения правильно. – [Электронный ресурс]. – URL: https://medza.ru/listya-irgi-poleznye-svojstva-i-protivopokazaniya (дата обращения: 12.11.2021)
4. Пат. 2238554 Российская Федерация, МКИ G01 N33/15 N27/26. Способ определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ / В.П. Пахомов [и др.] (РФ). № 2003123072/15; заявл. 25.07. 03; опубл. 20.10.04, Бюл. – № 15. – 3 с.
5. Яшин А.Я. Прибор для определения антиоксидантной активности растительных лекарственных экстрактов и напитков / А.Я. Яшин, Я.И. Яшин // Журн. междунар. информационная система по резонансным технологиям. – 2004. – №34. – С. 10–14.
6. Яшин А.Я. Инжекционно-проточная система с амперометрическим детектором для селективного определения антиоксидантов в пищевых продуктах и напитках / А.Я. Яшин // Рос.хим. журн. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. – 2008. – № 2. – С.130–135.
7. Денисенко Т.А. Спектрофотометрическое определение суммы фенольных соединений в растительных объектах с использованием хлорида алюминия, 18-молибдодифосфата и реактива Фолина-Чокальтеу / Т.А. Денисенко, А.Б. Вишникин, Л.П. Цыганок // Аналитика и контроль. – – 19(4). – С. 373-380.
8. Денисенко Т.А. Особенности взаимодействия 18-молибдодифосфата и реактива Фолина-Чокальтеу с фенольными соединения / Т.А. Денисенко, А.Б. Вишникин, Л.П. Цыганок // Аналитика и контроль. – – № 19 (3). – С. 242-251.
9. Singleton V.L. Analysis of total phenols and oxidations substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent / V.L. Singleton, R. Orthofer, R.M. Lamuela-Raventos // Methods in enzymology. – – № 299. – P. 152-178.
10. Аджиахметова С.Л. Содержание фенолов (в том числе флавоноидов) и антиоксидантов в листьях Viscum album L. и Pyrus communis L / С.Л. Аджиахметова, Н.М. Червонная, Д.И. Поздняков и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – – Т. 24. № 2. – С. 15-22.
11. Леонова В.Н. Количественное определение суммы фенольных соединений в плодах Rhus typhina (L.) / В.Н. Леонова, И.В. Попов, О.И. Попов и др. // Химия растительного сырья. – 2019. – №1– С. 225-232.
12. Государственная фармакопея Российской Федерации [Электронный ресурс]. 14-е изд. URL: http://femb.ru/feml. (дата обращения: 12.11.2021)
13. Волкова А.А. Исследование полифенольных соединений одно- и двулетних побегов вишни обыкновенной (Cerasus vulgaris Mill.):дис .... канд. фарм. наук: 14.04.02 / Волкова Алла Андреевна. – Пятигорск, 2011. – 159 с.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Shedbush // Wikipedia. [Electronic resource]. URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Irga (accessed 15.11.2021) [in Russian]
2. Irga: obzor jagodnogo kustarnika i sekrety ego vyrashhivanija [Shadbush: an overview of the berry bush and the secrets of its cultivation] // Ferma.expert [Electronic resource]. URL: https://ferma.expert/rasteniya/derevya/irga/irga (accessed 15.11.2021) [in Russian]
3. Primenjaem list'ja irgi dlja lechenija pravil'no [Correctly Applying Shadbush leaves for treatment]. [Electronic resource]. URL: https://medza.ru/listya-irgi-poleznye-svojstva-i-protivopokazaniya (accessed: 15.11.2021) [in Russian]
4. 2238554 Russian Federation, MCI G01 N33/15 N27/26. Sposob opredelenija summarnojj antioksidantnojj aktivnosti biologicheski aktivnykh veshhestv [A method for determining the total antioxidant activity of biologically active substances] / V.P. Pakhomov [et al.] (RF). No. 2003123072/15; application 25.07. 03; publ. 20.10.04, Bull. – No. 15– - 3 p. [in Russian]
5. Yashin A.Ya. Pribor dlja opredelenija antioksidantnojj aktivnosti rastitel'nykh lekarstvennykh ehkstraktov i napitkov [A device for determining the antioxidant activity of herbal medicinal extracts and beverages] / A. Ya. Yashin, Ya. I. Yashin // Zhurn. mezhdunar. informacionnaja sistema po rezonansnym tekhnologijam [Journal. international. information system on resonant technologies]. - 2004. - No. 34. - pp. 10-14 [in Russian]
6. Yashin A.Ya. Inzhekcionno-protochnaja sistema s amperometricheskim detektorom dlja selektivnogo opredelenija antioksidantov v pishhevykh produktakh i napitkakh [Injection-flow system with an amperometric detector for the selective determination of antioxidants in food and beverages] / A. Ya. Yashin // Ros.khim. zhurn. Ros. khim. ob-va im. D.I. Mendeleeva [Russian Chemical Journal]. - 2008. - No. 2. - pp.130-135 [in Russian]
7. Denisenko T.A. Spektrofotometricheskoe opredelenie summy fenol'nykh soedinenijj v rastitel'nykh ob"ektakh s ispol'zovaniem khlorida aljuminija, 18-molibdodifosfata i reaktiva Folina-Chokal'teu [Spectrophotometric determination of the number of phenolic compounds in plant objects using aluminum chloride, 18-molybdenum diphosphate, and Folin-Chokalteu reagent] / T. A. Denisenko, A. B. Vishnikin, L. P. Tsyganok // Analitika i kontrol' [Analytics and control]. -2015. - 19(4). - 373-380 [in Russian]
8. Denisenko T.A. Osobennosti vzaimodejjstvija 18-molibdodifosfata i reaktiva Folina-Chokal'teu s fenol'nymi soedinenija [Features of the interaction of 18-molybdenum diphosphate and Folin-Chokalteu reagent with phenolic compounds] / A. Denisenko, A. B. Vishnikin, L. P. Tsyganok // Analitika i kontrol' [Analytics and control]. – 2015. – № 19 (3). – pp. 242-251 [in Russian]
9. Singleton V.L. Analysis of total phenols and oxidations substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent / V.L. Singleton, R. Orthofer, R.M. Lamuela-Raventos // Methods in enzymology. – – № 299. – P. 152-178.
10. Adjiakhmetova S.L. Soderzhanie fenolov (v tom chisle flavonoidov) i antioksidantov v list'jah Viscum album L. i Pyrus communis L [The content of phenols (including flavonoids) and antioxidants in the leaves of Viscum album L. and Pyrus communis] / S. L. Adzhiakhmetova, N. M. Chervonnaya, D. I. Pozdnyakov, et al. // Voprosy biologicheskojj, medicinskojj i farmacevticheskojj khimii [Issues of biological, medical and pharmaceutical chemistry]. - 2021. - Vol. 24. 2. - pp. 15-22 [in Russian]
11. Leonova V.N. Kolichestvennoe opredelenie summy fenol'nykh soedinenijj v plodakh Rhus typhina (L.) [Quantitative determination of the amount of phenolic compounds in fruitsRhus typhina (L.)] / V. N. Leonova, I. V. Popov, O. I. Popov // Khimija rastitel'nogo syr'ja [Chemistry of plant raw materials]. – 2019. - No. 1- pp. 225-232 [in Russian]
12. The State Pharmacopoeia of the Russian Federation [Electronic resource]. 14th ed. URL: http://femb.ru/feml (accessed 15.11.2021) [in Russian]
13. Volkova A.A. Issledovanie polifenol'nykh soedinenijj odno- i dvuletnikh pobegov vishni obyknovennojj (Cerasus vulgaris Mill.) [Investigation of polyphenolic compounds of one- and two-year-old cherry shoots (Cerasus vulgaris)]: Candidate's thesis. Pharmaceutical Sciences: 04/14/02 / Volkova Alla Andreevna. - Pyatigorsk, 2011– 159 p. [in Russian]