AN EXPERIMENTAL EXAMINATION OF THE FEATURES OF TOTAL CEREBRAL ISCHEMIA IN COMBINATION WITH HYPERGLYCEMIA IN RATS UNDER CONTROLLED TEMPERATURE CONDITIONS

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ТОТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА В СОЧЕТАНИИ С ГИПЕРГЛИКЕМИЕЙ, В УСЛОВИЯХ КОНТРОЛИРУЕМОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Научная статья

Коробков Д.М.^1, *, Вечканова Н.А.², Ивашин А.А.³, Степанов Н.Ю.⁴, Прокофьев Д.А.⁵

^1-5 Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва, Саранск, Россия

* Корреспондирующий автор (doctordmk[at]mail.ru)

Аннотация

Целью нашего исследования было изучение особенностей 30-ти минутной тотальной ишемии головного мозга в сочетании с гипергликемией, в условиях контролируемой температуры у крыс в эксперименте. Исследование выполнено на 30 нелинейных белых крысах обоего пола массой 250-300 г. Животные подверглись 30-минутной тотальной ишемии, вызванной окклюзией обеих общих сонных артерий по методике Пошивалова В. П., с последующей реперфузией.

В ходе эксперимента было установлено, что уровень гликемии у животных групп 2 и 3, были статистически значимо выше в сравнении с группой контроля (группа 1), р<0,05. В группах животных 2 и 3 количество нейронов разных фенотипов, консолидированных в пары, была в 2,3 раза больше, чем в группе контроля (р<0,05). Таким образом, эти данные указывают на то, что гипергликемия потенциально может усугубить ишемическое повреждение головного мозга, предположительно, за счет увеличения цереброваскулярной проницаемости и нарушения механизмов перфузионно-метаболического соответствия.

Ключевые слова: тотальная ишемия головного мозга, реперфузия, гипергликемия.

AN EXPERIMENTAL EXAMINATION OF THE FEATURES OF TOTAL CEREBRAL ISCHEMIA IN COMBINATION WITH HYPERGLYCEMIA IN RATS UNDER CONTROLLED TEMPERATURE CONDITIONS

Research article

Korobkov D.M.^1, *, Vechkanova N.A.², Ivashin A.A.³, Stepanov N.Yu.⁴, Prokofyev D.A.⁵

^1-5 N.P. Ogarev National Research Mordovian State University, Saransk, Russia

* Corresponding author (doctordmk [at]mail.ru)

Abstract

The aim of the current study was to experimentally examine the features of 30-minute total cerebral ischemia in combination with hyperglycemia in rats under controlled temperature conditions. The study was performed on 30 non-pedigree white rats of both sexes weighing 250-300 g. The animals underwent 30-minute total ischemia caused by occlusion of both common carotid arteries according to the technique of V. P. Poshivalova, followed by reperfusion.

During the experiment, it was found that the level of glycemia in animals of groups 2 and 3 was statistically significantly higher in comparison with the control group (group 1), p<0,05. In animal groups 2 and 3, the number of neurons of different phenotypes consolidated into pairs was 2.3 times greater than in the control group (p<0,05). The data indicate that hyperglycemia can potentially worsen ischemic brain damage, presumably due to increased cerebrovascular permeability and impaired perfusion-metabolic correspondence mechanisms.

Keywords: total cerebral ischemia, reperfusion, hyperglycemia.

Главным субстратом образования энергии для мозга является глюкоза. Утилизация глюкозы в основном происходит в результате аэробного гликолиза, поэтому для нормальной работы мозга необходимо стабильное поддержание напряжения кислорода в крови [1].

Доказанным фактом является то, что гипергликемия усугубляет ишемическое поражение головного мозга. Впервые эмпирическим путем это было доказано в исследованиях Wagner K.R. et al. (1986) на моделях глобальной ишемии [2].

В одном из своих исследований Lau L. et al. (2019) показали, что выживаемость крыс в первые сутки после 10-минутной глобальной ишемии головного мозга в условиях нормогликемии была статистически значимо выше, в сравнении с крысами в условиях гипергликемии (летальность в первые сутки составила 100%) [3].

Anrather J. et al. (2016) на модели очаговой ишемии переднего мозга продемонстрировали, что у крыс, которым вводили глюкозу за 20-минут до эксперимента отмечались более выраженные вторичные поражения головного мозга, а как следствие отек головного мозга [4].

Клинические наблюдения показывают, что высокий уровень гликемии у пациентов является фактором риска развития инсульта и коррелирует с неблагоприятным прогнозом [8,9]. Усиление отека мозга после ишемии головного мозга в условиях гипергликемии, сегодня рассматривается как итог постишемического повреждения мозговой ткани [10]. В условиях оксидативного стресса и локального воспаления происходит нарушение кальциевого гомеостаза, формируется глутаматная эксайтотоксичность, лактат-ацидоз, все эти процессы протекают длительно, тем самым способствуя диффузному повреждению ЦНС.

К настоящему времени изучение механизмов ишемического повреждения головного мозга и их лечения достигло колоссальнейших успехов, однако многие аспекты остаются не изученными, и в литературе встречаются весьма противоречивые данные поэтому исследования в этой области остаются по-прежнему актуальными.

Целью нашего исследования было изучение особенностей 30-ти минутной тотальной ишемии головного мозга в сочетании с гипергликемией, в условиях контролируемой температуры у крыс в эксперименте.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на 30 нелинейных белых крысах обоего пола массой 250-300 г. Все манипуляции с животными проводились в соответствии с Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных [5]. Животным проводилось анестезиологическое пособие, включающее интраперитонеальное введение препаратов: «Золетил 100» (из расчета 8мг/кг) и «Ксилазин» (из расчета 0,5 мл/кг) [1]. После чего животные подверглись 30-минутной тотальной ишемии, вызванной окклюзией обеих общих сонных артерий по методике Пошивалова В. П. (1978), с последующей реперфузией [6]. Производилась респираторная поддержка, с целью обеспечения физиологических значений PaСО₂ и PaО_2. Для согревания животных обкладывали емкостями с горячим раствором и укрывали теплоизоляционным одеялом для поддержания оптимальной температуры в условиях эксперимента. Для обеспечения гипотермии животных обкладывали емкостями с охлажденным раствором и укрывали теплоизоляционным одеялом, а также дополнительно вводили в латеральную хвостовую вену охлажденный 0,9% раствор NaCl.

На аппаратном комплексе «BIOPAC» проводилось измерение PaСО₂ и PaО_2, среднего артериального давления и температуры в соответствии со стандартными методиками [7]. Определение рН и уровня глюкозы венозной крови проводилось на анализаторе pHOx Ultra Nova Biomedical (США) в соответствии со стандартными методиками. Группа животных 1 (крысы с нормогликемией, t=37⁰C (n=10)), были ограничены в пище за 12 часов до эксперимента и получили 1,5 мл физиологического раствора NaCl за 15 минут до начала эксперимента. Группа животных 2 (крысы с гипергликемией, t=37⁰C (n = 10)) получили внутрибрюшинную инъекцию 1,5 мл 40% раствора глюкозы за 15 минут до тотальной ишемии. Группа животных 3 (крысы с гипергликемией, t=33⁰C (n = 10)) получили внутрибрюшинную инъекцию 1,5 мл 40% раствора глюкозы за 15 минут до тотальной ишемии. На следующем этапе производилось морфологическое исследование. Головной мозг извлекался из черепной коробки, происходила фиксация в 10% нейтральном формалине, с дальнейшей проводкой в спиртах, затем происходило получение парафиновых блоков с последующим окрашиванием срезов гематоксилином и эозином, и тионином по методу Ниссля. Для статистической обработки данных, полученных в ходе эксперимента, был применен пакета программ «Statistica 6.0». Был применен параметрический t-критерий Стьюдента и критерий Манна-Уитни. Результаты представлены следующим образом, М ± m (М - среднее, m - ошибка среднего). Различия принимались за статистически значимые при p < 0,05.

Результаты и их обсуждение

Уровень гликемии у животных групп 2 и 3, были статистически значимо выше в сравнении с группой контроля (группа 1), р<0,05 (Таблица 1).

 

Таблица 1 – Физиологические параметры животных до моделирования тотальной ишемии

Показатель	Группа 1 (контроль) Нормогликемия t=370С (n=10)	Группа 2 Гипергликемия t=370С (n=10)	Группа 3 Гипергликемия t=330С (n=10)
PaCO2 (мм.рт.ст)	39,3±2,76	42,1±3,07	38,31±2,12
PaO2 (мм.рт.ст)	127±8,87	146±12,4	125±10,14
Среднее артериальное давление (мм.рт.ст)	124,2±12	125±7,54	125±4,75
рН	7,43 ±0,03	7,33±0,029	7,46 ±0,03
Уровень глюкозы крови (ммоль/л)	6,4±1,45	19,2±3,97*	16±3,13*

Примечание: *- статистическая значимость отличия по отношению к показателям группы контроля при р<0,05  

Выраженная сеть пирамидных нейронов неокортекса в группах 1,2,3 имела модульную организацию. При анализе фронтальных срезов нами обнаружено, что вертикальные пучки крупных дендритов нижерасположенных нейронов делили неокортекс на столбики. Особенно выраженные участки перивазальных отеков были у животных в группе 2.

Умеренное образование и расширение перикапиллярных пространств, также было обнаружено и у животных в группе №3. Стоит отметить, что наибольшие по площади участки гиперхромии-сморщивания отмечены нами у животных во 2-й группе. При окраске по Нисслю, нами замечено, что нейроны при ишемии имели заведомо более светлый фенотип, в следствии набухания, они были увеличены в объеме, и имели более округлую форму. В группе 2 преобладали клетки-«тени» на 40% в сравнении с группой 3.

В группах животных 2 и 3 количество нейронов разных фенотипов, консолидированных в пары, была в 2,3 раза больше, чем в группе контроля (р<0,05). Настоящее исследование показало, что гипергликемия значительно усугубляет последствия тотальной ишемии головного мозга у крыс в эксперименте. Хотелось бы отметить, что эти данные получены во время фазы реперфузии.

Таким образом, эти данные указывают на то, что гипергликемия потенциально может усугубить ишемическое повреждение головного мозга, предположительно, за счет увеличения цереброваскулярной проницаемости и нарушения механизмов перфузионно-метаболического соответствия. Можно с уверенностью сказать, что при ишемии повышение температуры является критическим фактором в определении тяжести постишемического повреждения мозговых структур.

Пока не до конца ясно, как гипергликемия может повлиять на структуру и функциональность эндотелия, и как она повлияет на постишемическое повреждение гематоэнцефалического барьера при реперфузии.

Выводы

В ходе исследования выявлено, что преишемическая гипергликемия усиливает повреждение нейронов и глиальных клеток после тотальной ишемии. Выраженность тканевого ацидоза играет основополагающую роль в переходе от селективного некроза нейронов к инфаркту мозга. Поскольку астроциты участвуют в поддержании энергетического метаболизма мозговой ткани, повреждение этого типа клеток в условиях гипергликемии приводит к изменению сосудистой проницаемости, в этих условиях приобретенная дисфункция эндотелия может представлять собой важный механизм, по средствам которого гипергликемия способна влиять на ишемический исход.

Конфликт интересовНе указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Inchina V.I. Study of peculiarities of expression of neurological deficiency in rats with cerebral pathology of traumatic genesis and acute hypoxia in the acute period / V.I. Inchina, D.M. Korobkov, A.O. Petrunin A.O // Modern problems of science and education. -2020.-№3.-P. 100.
2. Wagner K.R. Brain metabolic correlates of hypoxic-ischemic cerebral necrosis in mid-gestational sheep fetuses: significance of hypotension / K.R. Wagner, P. Ting, M.V. Westfallet al. // Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. -1986. -№6(4). –Р. 425-434.
3. Lau L. Prevalence of diabetes and its effects on stroke outcomes: A meta-analysis and literature review / L.Lau, J. Lew, K. Borschmann et al. // Journal of Diabetes Investigation. -2019.- №10(3). –Р. 780-792.
4. Anrather J. Inflammation and Stroke: An Overview / J. Anrather, C. Ladecola // Neurotherapeutics. -2016. -№ 13. –Р. 661–670. https://doi.org/10.1007/s13311-016-0483-x
5. Annex A. To The European Convention On The Protection Of Spine Animals Used For Experiments And Other Scientific Purposes (Ets №. 123) Guidelines For The Maintenance And Care Of Laboratory Morals (Laboratory) / A. Annex. 2006. [Electronic resource]. URL:http://conventions.coe.int/Treaty/EN/Treaties/PDF/123- Arev. pdf (accessed: 15.09.2021).
6. Poshivalov V.P. Ethological atlas for pharmacological research on laboratory rodents / V.P. Poshivalov. - M., 1978. Dep. in VINITI, №. 3164 - 3178.
7. Reference Manual for AcqKnowledge® 4.4 Software & MP150/MP36R, BioHarness, B-Alert Mobita or Stellar Hardware/Firmware on Windows® 10, 8, 7 or Vista, or Mac OS® X 10.5-10.9 [Electronic resource]. URL: https://www.biopac.com/wp-content/uploads/BSL-PRO-3_7-Manual.pdf (accessed: 15.09.2021).
8. Vahidy F.S. Systematic review and meta-analysis of bone marrow-derived mononuclear cells in animal models of ischemic stroke / F.S. Vahidy, M.H. Rahbar, H. Zhu et al. // Stroke.- 2016. №47. –Р.1632-1639.
9. Singh V. HMGB1 as a key mediator of immune mechanisms in ischemic stroke / V.Singh, S. Roth, R. Veltkamp et al. // Antioxid Redox Signal. -2016.-№24.-Р.635-651.
10. Petrovic-Djergovic D. Inflammatory disequilibrium in stroke / D. Petrovic-Djergovic, S.N. Goonewardena, D.J. Pinsky // Circulation Research. -2016.-№119.-Р.142-158.