Comparison of the Apoptosis Intensity of Low-Differentiated Chicken Cardiomyocytes in Early Normal and Experimental Posttraumatic Cardiomyogenesis

Смертность людей от патологий, связанных с нарушением различных морфологических элементов сердца и кровоснабжающих его сосудов уже не одно десятилетие удерживает 1 место в мире [1]. В патогенезе атеросклероза, инфаркта миокарда, миокардита ведущую роль играет апоптоз – процесс генетически запрограммированной клеточной гибели, затрагивающий прежде всего невосполнимую у взрослого человека популяцию высокодифференцированных кардиомиоцитов [2]. Однако апоптоз развивающихся кардиомиоцитов по мнению ряда авторов [3], [4], [5] обнаруживается и в ходе нормального гистогенеза у экспериментальных животных и человека, являясь одной из важнейших составляющих в ходе кардиогенеза. Работы морфологов, посвященных закономерностям структурных проявлений, хронологическим и посттравматическим особенностям течения апоптотического процесса в ходе кардиогенеза крайне малочисленны.

Целью нашей работы являлось выявление и сравнение интенсивности морфологических проявлений апоптоза у малодифференцированных кардиомиоцитов эмбрионов кур, в ходе раннего нормального развития сердечной мышцы и, в те же сроки, после её локальной термотравмы.

С помощью светооптического гистологического, электронномикроскопического, морфометрического и иммуногистохимического методов в сравнительном аспекте изучался компактный и трабекулярный миокард развивающихся сердец куриных эмбрионов (обыкновенных домашних кур). Данные по забору материала в 2-х группах представлены в таблице №1.

Сердца эмбрионов в экспериментальной группе подвергались локальному термическому повреждению развивающегося сердца на 72-м часе после оплодотворения. Для этого над эмбрионом в скорлупе и волокнистой оболочке инкубированного яйца инъекционной иглой делались доступы диаметром 10-15 мм. Затем сердце повреждалось в области желудочков элекротермокаутером (в течение 5 секунд, температура 180 С). После эксперимента доступ в скорлупе закрывался стерильной полупроницаемой мембраной и яйцо снова помещалось в инкубатор. Сроки забора материала в контрольной и экспериментальной группах указаны в таблице №1. После стандартных этапов фиксации и обезвоживания сердца курных эмбрионов заливали в парафин, затем с помощью микротома ротационного типа КD-2260 из парафиновых блоков изготавливались серийные срезы толщиной 7 мкм., которые окрашивались гематоксилином-эозином и по Малори. После оценки качества полученных срезов проводилось иммуногистохимическое исследование (ИГХ), которое выполнено с использованием стандартных маркеров, выявляющих клетки, гибнущие апоптозом: р53 и Bcl 2. На полученных срезах подсчитывался также митотический индекс и интенсивность экспрессии ИГХ-маркера пролиферации Кi-67. Для трансмиссионной электронной микроскопии часть биоматериала, после соответствующей фиксации глутаральдегидом окрашивалась осмиевой кислотой, обезвоживалась и заливалась в аралдит. Из полученных блоков изготавливались прицельные полутонкие срезы, окрашиваемые толуидиновым синим. С помощью светооптической микроскопии полутонкие срезы анализировались и для дальнейшей обработки на полученных срезах выбирались участки компактного и трабекулярного миокарда. Из участков миокарда «прицеленных» блоков проводилось изготовление ультратонких срезов с последующим их контрастированием уранилацетатом. Полученные ультратонкие срезы просматривались и анализировались на электронном микроскопе Philips/FEI XL 30S FEG SEM; Scanning Electron Microscope EDAX EDS; ЭВМ-100 К и Tecnai G2 Spirit Bio TWIN с системой фотосъемки Tecnai Plate Camera System и цифровой видеокамерой высокого разрешения SIS Mega View III. Морфометрическое исследование включало количественную оценку клеток, гибнущих апоптозом на всех сроках исследования в контроле и эксперименте, а также степени выраженности интенсивности цветовых проявлений иммуногистохимических маркеров (экспрессии) по шкале: не выявляется (отрицательно), слабо выраженный, умеренный, интенсивный. На всех исследуемых сроках, с помощью окуляр – микрометра, на серийных гистологических срезах подсчитывался митотический индекс – МИ. Для объективизации полученных данных применялись методы вариационной статистики (биометрии) – лицензионный пакет компьютерных программ Statistica.

72 часа (только контроль)

р53 – реакция слабо положительная; Bcl 2 – реакция слабо выраженная; митоз МИ - 46±0.2; Кi-67 – реакция интенсивная. Электронная микроскопия – выявляются диффузно расположенные единичные клетки с морфологическими проявлениями апоптоза.

84 часа инкубации (12 часов после термотравмы)

Контроль: р53 - реакция слабо выраженная, Bcl 2 - реакция слабо выраженная, митоз МИ - 18±0.2; Электронная микроскопия - обнаруживаются единичные апоптотические тельца.

Травма: р53 - реакция слабо выряженная; Bcl 2 - реакция слабо выраженная; митоз МИ -16±0.2; Кi-67 – реакция умеренная; Электронная микроскопия - выявляются единичные кардиомиоциты с проявлениями апоптоза преимущественно на стадии апоптотических телец.

96 часа инкубации (24 часов после термотравмы)

Контроль: р53 - реакция интенсивная, Bcl 2- реакция интенсивная, митоз МИ - 18±0.01; Электронная микроскопия - обнаруживаются единичные клетки на различных этапах апоптоза.

Травма: р53 – реакция интенсивная; Bcl 2 – реакция интенсивная; митоз МИ 28±0.3; Кi-67 – реакция умеренная; Электронная микроскопия – в области повреждения обнаруживаются локальные группы кардиомиоцитов с морфологическими проявлениями апоптотической гибели (на разных этапах, в том числе и апоптотические тельца).

108 часа инкубации (36 часов после термотравмы)

Контроль: р53 – реакция отрицательная; Bcl 2 – реакция отрицательная; митоз МИ - 27±0.2; Кi-67 – реакция умеренная; Электронная микроскопия кардиомиоцитов гибнущих апоптозом не выявлено.

Травма: р53 - реакция отрицательная; Bcl 2 - реакция отрицательная; митоз МИ - 25±0.001; Кi-67 – реакция умеренная; Электронная микроскопия – кардиомиоцитов гибнущих апоптозом не выявлено.

Общее описание

На светооптическом уровне в трабекулярном и компактном миокарде на всех исследуемых сроках кардиомиогенеза обнаруживаются обширные группы и тяжи кардиомиоцитов с крупными ядрами, хорошо выраженными 1 или 2 ядрышками, фрагментарно базофильной цитоплазмой. Встречаются клетки с фигурами митоза. Обнаруживаются клетки эндотелия, формирующие примитивные сосуды. Иммуногистохимическое исследование показало, что клетки с интенсивной экспрессией в ядрах и цитоплазме ИГХ-маркеров Bcl-2 и р53, распределены диффузно выявляются и в развивающихся компактном, и в трабекулярном миокарде к 24 суткам после травмы (86 часов инкубации) Рис.1а. Прицельная электронная микроскопия позволяет утверждать, что гибнущие клетки не имеют связи с окружающими дифференцирующимися кардиомиоцитами и окружены неизмененными дифференцирующимися или митотически делящимися миоцитами. Специализированные контакты между ними полностью отсутствуют. Изменяется форма клетки. Ядра подобных кардиомиоцитов имеют инвагинации ядерной оболочки, конденсированный хроматин в виде мелких частиц, равномерно распределённых по всей нуклеоплазме. Объём кардиомиоцитов существенно уменьшается, однако целостность плазмолеммы не нарушается.  В цитоплазме сохраняется большинство клеточных структур, присутствует большое количество лизосом, цитоскелет уплотнен. Здесь же наблюдается наличие небольших по размеру митохондрий с умеренно плотным матриксом и развитыми кристами. Идет формирование различных по диаметру апоптотических телец. Рис.1б. Фото ИГХ и электроннограммы на рисунках 2а;2б демонстрируют отсутствие апоптотической активности продолжающих дифференцировку кардиомиоцитов на 108 часах инкубации (36 часов после травмы). Высокие показатели митотического индекса и появление миофибрилл свидетельствуют о продолжающемся кардиомиогенезе.

Ряд авторов [6], [7], [8]  утверждает, что запрограммированная на уровне генома смерть кардиомиоцитов в раннем развитии сердца необходима для нормального течения морфогенетических процессов. В частности – для образования межжелудочковых перегородок. В запуске посттравматического апоптоза участвуют различные компоненты клетки, прежде всего – плазматическая мембрана и митохондрии. Индукция апоптоза и активация проапоптотических белков ведёт к активации каспаз, расщепляющих белки – мишени. В результате происходит разрушение внутриклеточных органелл или их перестройка, фрагментация клетки на апоптотические тельца [9], [10], [11]. Из проведенного нами комплексного исследования формирующегося миокарда на стадии «трубчатого сердца» 86 часов инкубации следует, что среди клеточных элементов как компактного, так и трабекулярного участков миокарда встречаются единичные малодифференцированные кардиомиоциты на различных стадиях апоптотической гибели. Наше электронномикороскопическое исследование убеждает, что кардиомиоциты с проявлениями запрограммированной клеточной гибели в ходе раннего кардиомиогенеза располагаются единично и по отдельности выявлялись с 72 по 96 час инкубации. Через 24 часа после нанесения травмы они обнаруживаются группами и на разных хронологических этапах апоптотической гибели.  

Выводы. Из проведенного нами комплексного исследования следует:

1. Апоптотические проявления обнаруживаются в некоторых из дифференцирующихся кардиомиоцитов на 3-х исследуемых сроках (72,84,96 сутках) нормального кардиомиогенеза.

2. Через 24 часа после локальной термотравмы обнаруживаются статистически достоверно большее, чем в контрольной группе количество кардиомиоцитов гибнущих механизмом апоптоза.

3. К 108 часам инкубации у кур в обеих исследуемых группах дифференцирующихся кардиомиоцитов с морфологическими проявлениями генетически запрограммированной клеточной гибели не обнаруживается.

Заключение.

Процесс апоптоза малодифференцированных кардиомиоцитов у кур на ранних стадиях развития характерен для начальных этапов развития миокарда и связан не с травмой, а закономерностями раннего кардиомиогенеза. Несмотря на нанесение термической травмы в область развивающегося миокарда и гибели до 10% клеток, в сердечной мышечной ткани активируются процессы митоза, за счёт которого клеточная популяция дифференцирующихся кардиомиоцитов восполняется, а само развитие миокарда продолжается без дальнейших структурных нарушений.

Рисунок 1 - Компактный миокард куриного эмбриона:

1 - малодифференцированные кардиомиоциты на различных стадиях апоптотической гибели

Примечание: 84 часа инкубации; 24 часов после термотравмы; положительная реакция на маркер апоптоза Bcl-2; ув. х10

DOI:10.23670/IRJ.2022.124.26.2

Рисунок 2 - Электронномикороскопическое фото малодифференцированных кардиомиоцитов развивающегося миокарда куриного эмбриона через 24 часов после термотравмы на различных стадиях апоптотической гибели:

1 - уплотнения хроматина в ядрах кардиомиоцитов; 2 - апоптотические тельца

Примечание: 84 часа инкубации; ув. х 4200

DOI:10.23670/IRJ.2022.124.26.3

Рисунок 3 - Отрицательная реакция на маркеры апоптоза Bcl-2, р53:

1 - правое предсердие; 2 - правый желудочек

Примечание: сердце куриного эмбриона; 108 часов инкубации; 36 часов после локальной термотравмы

DOI:10.23670/IRJ.2022.124.26.4

Рисунок 4 - Продолжающие процессы цито дифференцировки в кардиомиоцитах куриного эмбриона:

1 - активный деспирализованный хроматин; 2 - группы полисом; 3 - формирующиеся миофибриллы

Примечание: 108 часов инкубации; 36 часов после нанесения локальной термотравмы; электронная микрофотография; ув. х7500

DOI:10.23670/IRJ.2022.124.26.5