A STUDY OF NEPHROTOXIC EFFECT OF MULTIMINERAL COMPLEX IN A CHRONIC EXPERIMENT

Жизненные функции организма напрямую связаны с химическим составом окружающей среды, а также содержанием в ней макро- и микроэлементов, участвующих в организации механизмов адаптации и функционировании сердечно-сосудистой, выделительной, пищеварительной, иммунной, эндокринной, а также центральной нервной системы. Для Северных территорий характерны дефицит и дисбаланс элементов, что в первую очередь отражается на состоянии здоровья жителей данных регионов.

Для предотвращения подобных дисэлементозов разработан и изготовлен мультиминеральный комплекс, дозировка которого была рассчитана на основании исследований элементного портрета населения Европейского Севера

Одной из задач нашего исследования явилось определение потенциальных токсических свойств мультиминерального комплекса при многократном повторном введении в разных дозах (терапевтической и кратно ее превышающей), выявление органов-мишеней и обратимости вызываемых повреждений. Все это позволит оценить риск потенциальных негативных последствий применения данного премикса, если таковые будут иметь место, что потребует дальнейшей доработки его состава или технологии.

Выделительная система относительно быстро может реагировать на токсическое действие извне. Главным органом выделительной системы являются почки, роль которых в организме не ограничивается только выделением конечных продуктов обмена и избытка неорганических и органических веществ, они также являются гомеостатическим органом. Соответственно, при нарушении функции почек происходит нарушение баланса организма и дестабилизация показателей обмена различных веществ

Целью исследования явилось изучение нефротоксического действия мультиминерального комплекса при применении на лабораторных животных.

Животные. Чаще всего для проведения подобных исследований используются крысы, которых применяют в качестве тест-систем для оценки острой и хронической токсичности. Для получения точных данных и их правильной интерпретации важно, чтобы состояние подопытных животных в начальной точке эксперимента было максимально схожим.

В работе были использованы 80 половозрелых крыс Вистар (Wistar) без внешних признаков патологии: самцы и самки (нерожавшие и небеременные) массой тела 200-300 г. в возрасте 12-14 недель, полученные из питомника лабораторных животных «Рапполово» (НИЦ «Курчатовский институт»). В ходе различных исследований подтверждена необходимость проведения эксперимента на животных обоих полов, так как в противном случае могут быть не зарегистрированы некоторые нежелательные эффекты, что категорически недопустимо.

Животных содержали в контролируемых условиях вивария: стандартный чередующийся фиксированный режим освещения (12 ч. свет, 12 ч. темнота); температура 22±20С; относительная влажность 30-70%; кратность воздухообмена 10/час; в стандартных клетках с подстилкой обеспыленной из деревянной стружки. В одной клетке находились преимущественно однопометники, при этом самки и самцы размещались отдельно друг от друга. Все крысы получали гранулированный корм (ГОСТ 34566-2019 «Комбикорма полнорационные для лабораторных животных. Технические условия»: содержание протеина более 25%, жиров 6-12%) ad libitum. На момент начала исследования животные были здоровы (получены данные клинического осмотра и серологических тестов). Адаптация к условиям эксперимента составила 5 дней.

Исследуемый минеральный комплекс. В работе было проведено исследование безопасности применения персонализированного минерального комплекса для профилактики дисэлементоза у жителей Северных территорий на лабораторных животных (Патент на изобретение RU 2688682 C1, 22.05.2019)

Поверхностные питьевые воды в Республике Карелия характеризуются недостаточной минерализацией (общая минерализация до 100 мг/л) и мягкостью (малое содержание Са2+ и Mg2+)

Для сравнения использовалась негазированная артезианская питьевая вода 1-й категории с общей минерализацией не более 1 г/л. Основной состав (мг/л): Хлориды 8,6; Сульфаты 5,1; Кальций 25,0; Магний 5,0; Калий 0,3; Натрий 4,7; Гидрокарбонаты 87,6. С содержанием Цинка 0,02мг/л и Селена менее 0,002 мг/л.

Способ введения и выбор доз. Минеральный комплекс был расфасован на отдельные дозы из расчета на массу животного. Для расчета отдельных доз активных веществ была проведена оценка массы тела лабораторных животных. Крысы взвешивались на электронных весах, после чего рассчитывалась средняя масса тела животных в граммах. Расчет дозировки действующих веществ минерального комплекса проводился на единицу массы тела животного (на 1 г), согласно дозировкам действующих веществ, указанным в Патенте на изобретение RU 2688682 C1. Далее с учетом процентного содержания элемента в субстанциях и средней массы тела лабораторных животных проводился расчет масс субстанций, необходимых для изготовления исследуемых доз минерального комплекса.

Исследование проводили с использованием того же пути введения, который предполагается для применения минерального комплекса у человека. Поэтому минеральный комплекс вводили перорально с кормом индивидуально каждому экспериментальному животному примерно в одно и то же время в дозах 0,0057 мг/г Кальция, 0,0025 мг/г Магния, 0,00007 мг/г Цинка и 0,0000004 мг/г Селена (условно-терапевтическая доза), а также в дозировке в 10 раз превышающих терапевтические. Добавки вводили один раз в сутки в течение 60 дней ежедневно. Период отсроченного наблюдения составил 60 суток. При введении мультиминерального премикса проводили регулярную коррекцию его количества в корме для компенсации колебаний, обусловленных ростом животных и изменением объема потребления корма и воды.

Животным группы сравнения была предоставлена минеральная вода без ограничения по той же схеме, что и прием минеральной добавки. Крысам группы контроля обеспечили доступ к отстоянной местной водопроводной воде.

Дизайн исследования. Для оценки возможного токсического действия на выделительную систему животных при многократном введении был разработан дизайн эксперимента, одобренный биоэтической комиссией, с учетом современных норм биоэтики и соблюдения основных принципов 3R (Replacement, Reduction, Refinement – замена, сокращение, улучшение) с использованием минимального количества животных, согласно требованиям Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств

После окончания срока карантинного изолирования (14 суток) крысы были рандомизированно разделены на 4 группы. Первая экспериментальная группа (10 самцов и 10 самок) ежедневно в течение 60 суток получала исследуемый минеральный комплекс в терапевтической дозе (TD) и местную отстоянную водопроводную воду без ограничения. Вторая экспериментальная группа (10 самцов и 10 самок) ежедневно в течение 60 суток получала исследуемый минеральный комплекс с увеличенной терапевтической дозой в 10 раз (10TD) и местную отстоянную водопроводную воду без ограничения. Третья группа сравнения (10 самцов и 10 самок) получала вместо водопроводной воды – минеральную воду на протяжении 60 суток (MW). Четвертая контрольная группа (10 самцов и 10 самок) получала только местную отстоянную водопроводную воду без ограничения. На протяжении всего эксперимента животные находились под ежедневным наблюдением.

Для определения диуреза и потребления воды крыс помещали на сутки в индивидуальные метаболические клетки (Tecniplast, Италия), снабженные поилками, что обеспечивало сбор чистых образцов мочи без загрязнения фекалиями, кормом или иными примесями. Исследование проводили до применения добавки и минеральной воды, затем на 30 и 60 сутки эксперимента, и далее через 2 месяца после окончания эксперимента. Мочу собирали в течение 24 часов, после чего ее количество регистрировали. Процесс измерения потребления воды проводили вручную, при измерении мерной колбой определяли разницу между количеством оставшейся воды в поилке и начальным количеством, предварительно измеренным

При помощи универсальных диагностических тест-полосок (URS-10, Teco Diagnostics (США)) производили исследование физико-химического состава мочи. Исследовали следующие параметры: рН, удельный вес, а также определяли содержание билирубина, кетонов, эритроцитов, белка, нитритов, уробилиногена, глюкозы и лейкоцитов. При получении образцов мочи следует учитывать тот факт, что в течение ночи грызуны более активны, в связи с чем увеличивается потребление ими пищи и воды, что сказывается на концентрации некоторых веществ в моче. В течение дня, когда животные менее активны, концентрация этих веществ быстро снижается. Учитывая данный факт, важно собирать образцы мочи у грызунов последовательно в одно и то же время, поэтому для исследования брали утреннюю порцию мочи животных, собирали в сухие чистые сосуды, тест-полоски быстро окунали в мочу и с помощью мочевого анализатора Uritek 151 оценивали вышеуказанные параметры мочи.

Биохимический анализ крови также производили до применения добавки и минеральной воды, затем на 30 и 60 сутки эксперимента, и далее через 2 месяца после окончания эксперимента на биохимическом анализаторе «Rokki» (Япония) с помощью набора реактивов «Ольвекс Диагностикум» (Санкт-Петербург) и в соответствии с инструкциями производителя. Оценивали концентрацию креатинина (мкмоль/л) и мочевины (ммоль/л) в плазме крови.

Содержание подопытных животных и все манипуляции с ними в рамках эксперимента соответствовали требованиям международных и российский законодательных актов (ETS123, Strasbourg,1986; Директива 2010/63/EU от 22.09.2010 г; ГОСТ 33216-2014, ГОСТ 33215-2014 СП 2.2.1.3218-14)

Анализ данных. Полученные в экспериментах результаты подвергали статистической обработке с помощью компьютерного пакета программ Statistica 8.0 и представлена в виде средней арифметической и ошибки средней арифметической (М±m). Достоверность результатов оценивали по непараметрическому U критерию Уилкоксона-Манна-Уитни. Достоверно различающимися признавали значения при р<0,05; при 0,05<р<0,1 различия между средними имели тенденцию к достоверности. Расчет выполняли отдельно для каждого показателя у самцов и самок.

В течение 2 месяцев эксперимента во время приема минерального комплекса в двух исследуемых дозировках, а также минеральной воды, а затем 2 месяцев наблюдения за животными, общее состояние крыс во всех группах было удовлетворительным и соответствовало половозрастным особенностям. Внешний вид, состояние шерсти и слизистых, спонтанная двигательная активность в тесте «открытое поле» опытных групп и группы сравнения не отличались от контроля.

Влияние минеральной добавки на потребление жидкости. Ежемесячная регистрация количества выпитой жидкости у крыс, получающих минеральную добавку в терапевтической и в 10 раз превышающих терапевтическую, а также минеральную воду, выявила относительную стабильность данного показателя.

Достоверные изменения потребления воды были отмечены у крыс, которые потребляли минеральную воду. Для самцов данный показатель имел достоверно большие значения внутри группы относительно времени начала эксперимента. Достоверных отличий с группой контроля выявлено не было (табл. 1).

Достоверные изменения в потреблении минеральной воды были также отмечены и у самок крыс. Во время приема минеральной воды зарегистрировано увеличенное потребление жидкости. В этой группе отличия были установлены не только в сравнении с временем начала исследования, но и в сравнении группой контроля (р<0,05) (табл. 1).

Статистически значимых различий в потреблении жидкости между крысами разного пола не было выявлено.

Влияние минеральной добавки на суточный диурез. В ходе эксперимента достоверных различий в объеме суточного диуреза у самцов и самок (табл. 2) крыс отмечено не было.

Данный показатель оставался на стабильном уровне в ходе всего исследования.

Влияние минеральной добавки на физико-химические показатели мочи. Лабораторный анализ образцов мочи является неотъемлемой частью проведения исследования, необходимого для оценки состояния почек и мочевыводящих путей, это один из наиболее информативных и часто выполняемых лабораторных тестов для определения общего состояния здоровья и физиологического состояния животного, а также влияния минерального комплекса на мочевыделительную систему. Для данного вида исследований часто используют тест-полоски для анализа мочи человека (метод «сухой химии»). Этот полуколичественный метод является простым и быстрым, так как моча является одной из самых доступных биожидкостей, а спонтанная патология мочевыделительной системы у крыс встречается достаточно часто.

В течение эксперимента величина рН мочи во всех группах изменялась в диапазоне от 6,0 до 7,5, что соответствует литературным данным

На протяжении всего эксперимента содержание кетоновых тел в моче у самцов крыс обнаружено не было (табл. 3). Лишь к концу исследования было зафиксировано повышение кетонов, но в пределах физиологической нормы, что можно связать с возрастом животных.

Кетоны в моче у самок крыс также были отмечены лишь к концу эксперимента во всех экспериментальных группах и имели более низкие показатели в сравнении с особями мужского пола (табл. 3). При анализе количества белка в моче у животных достоверных отличий экспериментальных групп с группой контроля зафиксировано не было. Содержание уровня белка на протяжении всего времени эксперимента имело максимальные значения до 0,3 г/л, что является нормой.

Влияние минеральной добавки на биохимические показатели крови. Известно, что концентрация креатинина в крови в физиологических условиях имеет относительно постоянные значения, что объясняется зависимостью между образованием креатинина и его выделением

Установлено, что увеличение концентрации мочевины в крови может говорить об ухудшении функции почек. Исследование данного параметра показало относительную стабильность у животных обоего пола в экспериментальных группах, а также в группе сравнения и группе контроля (табл. 5), что указывает на отсутствие нефротоксичности у исследуемого премикса.

При изучении безопасности применения персонализированного минерального комплекса для профилактики дисэлементоза у жителей Северных территорий на показатели основных функций почек самцов и самок крыс не было зарегистрировано нефротоксического действия. Проведенные исследования показали, что многократное введение добавки в условно-терапевтической и десятикратно ее превышающей дозах не вызвало нежелательных побочных эффектов со стороны выделительной системы. Достоверные отличия с группой контроля были установлены лишь в потреблении воды при замене питьевой воды на минеральную.

Полученные данные свидетельствуют о наличии у тестируемого минерального комплекса благоприятного профиля безопасности по отношению к выделительной системе.