ВЛИЯНИЕ МАЖОРНОГО QTL В ХРОМОСОМЕ 4 НА ПРИЗНАКИ ЯЙЦА ДОМАШНЕЙ КУРИЦЫ

Баркова О.Ю.¹, Смарагдов М.Г.²

¹Кандидат биологических наук, ²Кандидат биологических наук, Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных

ВЛИЯНИЕ МАЖОРНОГО QTL В ХРОМОСОМЕ 4 НА ПРИЗНАКИ ЯЙЦА ДОМАШНЕЙ КУРИЦЫ

Аннотация

В статье рассмотрено - влияние аллели SNP2_1 нуклеотидной последовательности CR523443 на признаки яйца домашней курицы. Выявлено достоверное влияние аллели SNP2_1 на толщину скорлупы, массу яйца 60 недель, яйценоскость 60 недель. Таким образом, SNP2_1 может быть рекомендован для использования в селекции кур несушек.

Ключевые слова: Локусы количественных признаков, однонуклеотидные замены, признаки яйца домашней курицы

Barkova O.Yu.¹,Smaragdov M.G.²

¹Candidate  of Biological Sciences, ²Candidate of Biological Sciences, All Russia Research Institute of AnimalGenetics and Breeding

INFLUENCE OF MAJOR QTL ON CHROMOSOME 4 FOR EGG TRAITS OF GALLUS GALLUS

Abstract

The article considers the influence of alleles SNP2_1 located on the nucleotide sequence CR523443  for traits of eggs of domestic chicken. There was a significant effect of allele SNP2_1 on shell thickness, egg weight for 60 weeks, egg production for 60 weeks. Thus, SNP2_1 can be recommended for use in breeding hens laying hens.

Key words: QTL (quantitative trait loci),chickens,genetic polymorphism

Причиной столь большого внимания, которое уделяется в настоящее время  однонуклеотидным полиморфным сайтам, является надежда на то, что они могут быть использованы в качестве маркеров для селекции по аллелям генов, оказывающих существенное влияние на хозяйственно ценные признаки (QTL).  Для выявления участков генома, в которых частота аллелей  SNP различается в разных генотипических  классах, рациональным подходом было бы генотипирование совокупности SNP в геноме. Полногеномное генотипирование  SNP теоретически возможно для полностью секвенированных геномов, для которых в публичном доступе имеется более миллиона SNP (человек, мышь, крупный рогатый скот, куры и т.д.). Производительность, необходимая для генотипирования нескольких тысяч SNP, и стоимость процедуры генотипирования с помощью сиквенса делают такие проекты в настоящее время очень дорогими. В настоящее время разработана технология генотипирования животных с использованием SNP- чипов, так называемая геномная селекция, которая нашла широкое применение в животноводстве и растеневодстве. В тех редких случаях, когда признак во многом определяется несколькими мажорными QTLs, имеет смысл вести селекцию только по этим QTLs.

За последние 10 лет с помощью генетического картирования хромосом домашней курицы были обнаружены сотни локусов количественных признаков (QTL), определяющих изменчивость хозяйственно-полезных признаков. Они все были интегрированы в базу данных расположенную на сайте (http://www.animalgenome.org/QTLdb). Исходя из данных этого сайта, нами был отобран  QTL в 4-ой хромосоме, влияющий на толщину скорлупы яиц.

В четвертой хромосоме курицы рядом с микросателлитом MCW0114 был картирован QTL, влияющий на толщину скорлупы яиц [1]. С помощью EST (экспрессирующих последовательностей ДНК) в ближайшем окружении микросателлита MCW0114 был обнаружен транскрипт - клон ChEST985k21, экспрессия которого коррелировала с толщиной скорлупы кур польской породы зеленоногая куропатчатая [2].

В непосредственной близости от последовательности CR523443 были обнаружены шесть SNP, три из которых ассоциировали с толщиной скорлупы яйца [3]. Наиболее достоверная ассоциация SNP – признак установлена для SNP2_1. Нами был осуществлен генетический анализ ассоциации SNP2_1 с рядом хозяйственно полезных признаков яиц

Для проведения экспериментов использованы куры двух линий коричнево скорлупного кросса УК Кубань 7, созданных на основе генофонда породы род-айленд. Отцовская линия УК-72 в материнской родительской форме типа белый род-айленд и материнская линия УК-73 в материнской родительской форме типа белый род-айленд с геном медленного оперения, сцепленным с полом. В обеих этих линиях отбор велся, в том числе и на повышение массы яйца. Также в экспериментах был использован двух-линейный гибрид CD родительской формы кросса Ломан Браун. Причем, отбор кур в этих линиях и кроссе осуществлялся, в том числе на прочность скорлупы. В работе использовали следующие признаки: 1. Средняя толщина скорлупы яйца в мкм. 2 средняя доля массы скорлупы от массы всего яйца в процентах 3. Средняя масса скорлупы в граммах. 4. Средняя интенсивность пигментации скорлупы яиц у кур 30, 60, недельного возраста. 5. Средняя яйценоскость кур 40, 60, недельного возраста. 6. Средняя масса желтка по отношению к массе яйца. 7. Средняя масса желтка в граммах. 8Средняя масса яйца у кур 30, 60, недельного возраста 9. Индекс формы 10. Средняя деформация скорлупы яйца без нарушения ее целостности в мм под воздействием груза весом 500 гр, снесенных курами 30,40 недельного возраста. Из 149 образцов крови была выделена ДНК с помощью фенол-хлороформного метода. Дизайн аллелеспецифических олигонуклеотидов-праймеров для генотипирования кур по аллелям SNP 2_1, расположенных рядом с последовательностью CR523443 проводили на основании информации баз данных сети интернет (www.nlm.ncbi.nih.gov) при помощи компьютерной программы PRIMER_3 (wwwgenome.wi.mit.edu). Величина амплифицируемого фрагмента была задана в пределах 200-500 п.н. и температура гибридизации при 60 °С. Проверка полученных последовательностей праймеров на предмет специфичности и отсутствия возможной внутригеномной гомологии была проведена при помощи пакета программ  BLAST.

Амплификацию ДНК при помощи ПЦР проводили с использованием амплификатора IQ-5 (Bio-Rad, США) в следующем режиме:

95º С – 5 минут;95º С – 1 м инута, 60º С – 1 минута, 72º С – 1 минута (30 циклов);72º С – 7 минут 4º С – хранение.

Pазделение фрагментов осуществляли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле. Фрагменты ДНК визуализировали в проходящих УФ лучах. Размеры фрагментов ДНК определяли при сравнении их с размерами фрагментов маркера  ДНК.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью однофакторного дисперсионного анализа. В качестве критерия достоверности использовали критерий Фишера F. Вычисления осуществляли при помощи пакета компьютерной программы Statistica 6.

Проведено генотипирование 149 курицы породы Род Айленд, линиям УК-72, УК-73 и межгибридному кроссу CD. Среди них 51 образец из линии УК-72, 73  из линии УК-73 и 25 из межлинейного гибрида CD.

Для генотипирования кур по аллелям SNP были использованы аллелеспецифические праймеры(полиморфные сайты выделены жирными буквами):

S2_1_Up_T: CTGCTCAGTGTCTTAGTCTGATCAGT

S2_1_Up_C: CTGCTCAGTGTCTTAGTCTGATCAGC

S2_1_Dn:     ACAGTCATGATGAGGAAACAGG

S3_2_Up_T: TTGCTCTCATTAATTAATGAGTTCAGT

S3_2_Up_C: TTGCTCTCATTAATTAATGAGTTCAGC

S3_2_Dn:      AGAAGGAAGAGAGGTATCAACCAGT

В табл. 1 представлены данные о величине толщины скорлупы яиц в зависимости от генотипа кур двух линий УК-72, УК-73 и гибрида CD а также у объединенной выборки всех кур. Из данных следует, что достоверный эффект замены аллелей SNP2_1 наблюдается у кур линии УК-72 и объединенной выборки всех кур, причем для кур линии УК-72 он составляет более одного стандартного отклонения. Следовательно, по силе влияния на толщину скорлупы яиц обнаруженный QTL относится к мажорным QTL.

Таблица 1 - Толщина скорлупы яиц в зависимости от генотипа кур.

С помощью дисперсионного анализа были проанализированы данные для 14-ти признаков, принимая во внимание все три генотипа кур СС, СТ и ТТ (табл. 2). Для линии УК-72 только для признаков масса скорлупы в граммах (Р = 0.06), яйценоскость 60-ти недельных кур (Р = 0.078) и толщина скорлупы яиц (Р = 0.07) значения достоверности приближаются к уровню значимости Р = 0.05. Масса скорлупы в граммах коррелирует с толщиной скорлупы яиц. Следовательно, эти данные согласуются друг с другом. Что касается яйценоскости 60-ти недельных кур, то это плейотропное влияние QTL (табл. 2). Для линии УК-73 различия между генотипами кур для всех признаков не достоверны, что является следствием недостаточного числа кур генотипа СС (2 курицы). У гибридов CD достоверность данных наблюдается для массы яиц у 60-ти недельных кур (Р = 0.002) и близкие к достоверным данные для массы скорлупы по отношению к массе яйца в процентах (Р = 0.07) и массы яиц у 30-ти дневных кур (Р = 0.09). Из литературных источников известно, что корреляция между массой яичной скорлупы и массой яйца не наблюдается. Следовательно, в данном случае имеет место плейотропный эффект QTL, но без доминантного эффекта аллеля Т.

Таблица 2 - Совместная ассоциация генотипов кур с признаками яйца

В итоговой табл. 3 представлены сводные данные для признаков, имеющих достоверные и близкие к достоверным данные у кур с разными генотипами и принадлежащих к линии УК-72 и межлинейному гибриду CD. К этим признакам относятся толщина скорлупы и масса скорлупы, а так же  яйценоскость и масса яиц у 60-ти недельных кур. Следует отметить совпадение направление эффекта (положительное) аллеля Т как для массы скорлупы, так и толщины скорлупы (линия УК-72). Также наблюдается тенденция большего эффекта аллеля Т для массы скорлупы, чем для массы яйца. Эти тенденции хорошо согласуются с отрицательным влиянием аллеля Т на массу яйца 60 недельных кур (гибрид.CD).

Таблица 3 - Связь генотипа кур с признаками яйца.

Таким образом, полученные результаты подтверждают ассоциацию SNP1_2 с толщиной скорлупы яиц кур породы род-айленд. Межлинейные различия обусловлены разной частотой генотипов кур, принадлежащих той или иной линии, что обусловлено селекцией и генетическим дрейфом, имевшим место при формировании каждой линии. Впервые рассчитан эффект замещения аллелей SNP2_1 на толщину скорлупы и установлено доминирование аллеля Т.

Многие из перечисленных ассоциаций SNP2_1 с признаками качества яйца  зависят от анализируемой линии кур, что может быть обусловлено разной частотой встречаемости генотипов СС, СТ, и ТТ. а также разной величиной неравновесия по сцеплению в линиях между SNP2_1 и QTL, и, следовательно, от истории селекции линий. Поэтому необходимо каждую линию кур анализировать отдельно. Совместный анализ нескольких линий кур может привести к потере или искажению информации о связи SNP с признаком.

Литература

1. Wardecka B., Olszewski R., Jaszczak K. et al. Preliminary mapping of QTL,s affecting egg quality on chromosomes 1-5 in chickens.// Czech J. Anim. Sci., –2003. –V. 48. –P. 97-105.
2. Sazanov A.A., Stekolnikova V.A., Korczak M. et al. Expression of positional candidates for shell thickness in the chicken. // Poultry Sci. –2007. –V. 86. –P. 202-205.
3. Баркова О. Ю., Сазанова А.Л., Благовещенский И.Ю. и др. Создание системы генотипирования Gallus gallus по аллелям rSNP (регуляторных мононуклеотидных полиморфных сайтов), оказывающих влияние на толщину скорлупы яйца.// Генетика. –2011. –Т. 47. – №2. – С. 241-248.

References

1. Wardecka B., Olszewski R., Jaszczak K. et al. Preliminary mapping of QTL,s affecting egg quality on chromosomes 1-5 in chickens.// Czech J. Anim. Sci., –2003. –V. 48. –P. 97-105.
2. Sazanov A.A., Stekolnikova V.A., Korczak M. et al. Expression of positional candidates for shell thickness in the chicken. // Poultry Sci. –2007. –V. 86. –P. 202-205.
3. Barkova O.Yu., Sazanova A.L., Blogoveshanskii I.Yu., i  gr. Sozdanie sistemi genotipirovania Gallus gallus po alleliam rSNP(reguliatornih mononukleotodnih polimorfnih saitov), okaziavaushih vliianie na tolshinu ckorlupi iaica.//Genetica. –2011. –Т. 47. – №2. – S. 241-248.