ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК АЛЛОГЕННОГО ТРУПНОГО КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ

Засорин Б.В.¹, Курмангалиев О.М.², Насиров И.Н.³

¹Доктор медицинских наук, профессор; ²доктор медицинских наук, профессор; ³кандидат медицинских наук,  доцент, Западно-Казахстанский государственный медицинский университет им.М.Оспанова

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК АЛЛОГЕННОГО  ТРУПНОГО КОСТНОГО МОЗГА ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ

Работа выполнена в рамках НИР №гр 0113 РК 00986

Аннотация

В эксперименте на 80 крысах-самцах в возрасте 2,5 лет оценена степень влияния на сперматогенез и поведенческие реакции внутрибрюшинного введения мультипотентных мезенхимальных клеток, полученных из трупного костного мозга. Установлено, что введение клеточного продукта увеличивает концентрацию сперматозоидов в 1 мл, повышает процент подвижных спермиев и снижает процент их патологических форм. Комплексный анализ поведенческих реакций выявил активацию двигательной и эмоциональной активности, а так же улучшение других изученных параметров. Полученные эффекты стабильно сохраняется на протяжении 4 месяцев после клеточной терапии.

Ключевые слова: стромальные клетки костного мозга, семенники, сперматогенез, поведенческие реакции.

 

Zasorin B.V¹., Kurmangaliyev O.M²., Nasirov I.N³.

¹Doctor of Medical Sciences, professor, ²Doctor of Medical Sciences, professor, ³Candidate of Medical Sciences, West - Kazakhstan State Medical University after M.Ospanov

EXPERIMENTAL  ESTMATION  OF  USING MESENCHYMAL STROMAL  CELLS  OF  ALLOGENIC  OF A CORPSE MARROW FOR THE CORRECTION OF AGE CHANGES

Abstract

The experiment   on 80 rats-males in the age 2,5 shows the  degree of influence on sprmatoginesis and acftions of the reaction of inside abdominal with using multy patent mezinchemical cells, getting from corpse marrow. There was identify that intered of cell products is increase the  consentration of sperms in 1 ml, increase persentage of active sperm and decrease the persentage of thier patalogical form. The complex analysis of active reaction is identify active function and emotional activity,  also improvment the other studied parametrs. Getting effects keep the stability condition during 4 months after cell therathy.

Keywords:  stromal cells of marrow,  seeds of men, spermaytoginesis , behavior reactions.

  Активное внедрение методов регенеративной медицины в геронтологическую практику с целью улучшения качества жизни пожилых людей, способствует увеличению числа исследований, направленных на поиск новых клеточных продуктов и оценки их клинической эффективности. В связи с этим в последние 5 – 7 лет пробудился повышенный интерес исследователей к возможностям получения клеточных продуктов из трупного материала. Сегодня достаточно успешно выделяют способные к пролиферации стволовые клетки скелетной мускулатуры, клетки сердечной мышцы, костного мозга и т. д., в сроки от 14 до 21 суток после смерти [1, 2, 3]. Это открывает большие перспективы, как в вопросе стандартизации выделяемых клеточных культур, так и в решении этико-правовых проблем по их выделению и применению в клинике.  Однако следует подчеркнуть, что в настоящее время отмечается существенный недостаток работ,  направленных на оценку клинической эффективности клеточных продуктов,  получаемых из трупного материала. Эксперимент проведен на 80 крысах-самцах линии Август в возрасте 2,5 года, содержавшихся в условиях вивария на стандартных кормах. Животные были разделены на две группы: опытная, получавшая клеточную терапию, и контрольную. Аллогенные мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) выделялись из бедренных  костей 6 трехмесячных крыс, забитых методом декапитации  под эфирным наркозом и находившихся при температуре 0ºС в течение 7 дней. Забор костного мозга осуществлялся в соответствии со стандартными операционными процедурами, разработанными ранее [4]. Выделенные клетки культивировались в условиях in vitro до шестого пассажа, иммунофенотипировались и использовались в эксперименте. Введение ММСК животным опытной группы осуществлялось внутрибрюшинно, в объёме 1,0 мл с концентрацией стромальных клеток 2х10⁶ кл/мл. Изменения в уровне качества жизни оценивали по изменению поведенческих реакций [5].  Регистрировали характеристики поведения животных через 1, 2, 3 и 4 месяца. Проводили регистрацию следующих характеристик поведения животных: двигательная активность (количество пересеченных периферических секторов), ориентировочно-исследовательское поведение (вставание на задние лапки), груминг (косметическое ухаживание за своим телом) и эмоциональное состояние животных: дефекация (по количеству буллов) и диурез — по площади лужиц. Оценка влияния ММСК на характеристики поведения животного проводили путем сопоставления полученных величин, выраженных в процентах. Кроме того оценивали состояние сперматогенеза у «пожилых» животных, учёт результатов осуществляли через 2 и 4 месяца после введения клеток. Для оценки функционального состояния  семенников определяли концентрацию, подвижность и морфологию  спермиев,  полученных из хвостовой части эпидидимиса,  по методике Е.К. Милованова  в модификации Г.И. Егоровой [6]. Анализ полученных данных  показал, что через месяц после введения ММСК двигательная активность животных  увеличилась в 2 раза по сравнению с контролем, через 2 месяца в 5 раз, через 3 – почти в 8 раз. Однако через 4 месяца, двигательная активность в опытной группе снизилась (по отношению к максимуму) в 2 раза, но при этом превышая в 5 раз контрольные показатели. Следующим изученным параметром была оценка ориентировочно-исследовательского поведения (рисунок 1).

Рисунок 1 – Влияние ММСК на показатель «вертикальные стойки» у крыс.

Анализ полученных данных  показал достоверный рост изученного показателя, начиная со второго месяца после введения клеток (в 1,8 раза), через 3 месяца отмечен максимум показателя «вертикальные стойки», превышающий контрольные значения в 2,8 раза. Однако, как и в случае с двигательной активностью, через 4 месяца происходит некоторое снижения данного параметра в опытной группе животных, но превышающего в 2,5 раза контрольные данные. Груминг (косметическое поведение) крыс является важной характеристикой поведения животных в открытом поле. Более того, крысы большую часть времени уделяют вычесыванию своего тела, по сравнению с перемещением в пространстве. Анализ полученных данных (рисунок 2), выявил, что показатель косметического поведения в опытной группе животных в 1,5 – 1,8 раза выше по отношению к контролю и, начиная со второго месяца, достоверно не изменяется.

Рисунок 2 - Влияние ММСК на показатель косметического поведения (груминг)

Оценка эмоциональной активности животных  показала  ее повышение в опытной  группе  по отношению к контролю, в котором уровень указанного показателя снижается к концу периода наблюдения (рисунок 3).

Рисунок 3 – Влияние ММСК на эмоциональную активность крыс.

Сравнительный анализ полученных данных о характере сперматогенеза  показал, что у животных опытной группы в динамике происходит улучшение всех изученных показателей. В частности, через 2 месяца после введения клеток, концентрация сперматозоидов  составила (млн/мл) 15,5+2,1 в опытной группе против 7,7+2,3 в контрольной. При сравнении процента подвижных форм  сперматозоидов установлено, что в опытной группе их количество в 3,4 раза выше по сравнению с контролем (22,3+2,4% и 6,5+1,9% соответственно). Анализ данных о количестве патологически изменённых форм выявил туже тенденцию: 12,9+2,6% (опытная группа), 28,75+4,3% (контрольная группа). Через 4 месяца после введения ММСК, концентрация сперматозоидов  составила 12,7+3,3 в опытной группе против 5,6+2,1 в контроле. При сравнении процента подвижных сперматозоидов установлено, что в опытной группе их количество в 3 раза выше по сравнению с контролем (16,8+3,1% и 5,5+1,8% соответственно). Анализ данных о количестве патологически изменённых форм подтвердил ранее выявленную тенденцию: 16,7+1,9% (опытная группа), 32,5+4,9% (контрольная группа). Комплексный анализ полученных данных показал, что введение аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток трупного костного мозга способствует активации сперматогенеза у «пожилых» крыс. Это подтверждается  трёхкратным увеличением количества сперматозоидов. Кроме того, введение клеток повышает качество спермы, проявляющееся в увеличении процента подвижных сперматозоидов и уменьшением в 2,5 раза числа патологически изменённых форм. Достигнутые результаты сохраняются на протяжении 4 месяцев после внутрибрюшинного введения ММСК. ВЫВОДЫ:

1. Применение трупных ММСК у «пожилых» крыс улучшает показатели качества жизни животных.
2. Комплексный анализ поведенческих реакций выявил активацию двигательной и эмоциональной активности, а так же улучшение других изученных параметров.  Выявленные изменения носят стабильный характер.
3. Введение аллогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток трупного костного мозга активирует сперматогенез у «пожилых» крыс.
4. Улучшение качества спермы (процент подвижных сперматозоидов и патологически изменённые формы) носит стабильный характер.

Литература

1. Hodgetts SI, Stagg K, Sturm M, Edel M, Blancafort P. Long live thestem cell: the use of stem cells isolated from post mortem tissues for translational strategies. // Int J Biochem Cell Biol. 2014 Nov;56:74-81.
2. Latil M, Rocheteau P, Châtre L, Sanulli S, Mémet S, Ricchetti M, Tajbakhsh S, Chrétien F. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. // Nat Commun. 2012 Jun 12;3:903.
3. Perán M, López-Ruiz E, González-Herrera L, Bustamante M, Valenzuela A, Marchal J.A. Cellular extracts from post-mortem human cardiac tissue direct cardiomyogenic differentiation of human adipose tissue-derived stem cells. // Cytotherapy. 2013 Dec;15(12):1541-8.
4. Засорин Б.В., Курмангалиев О.М., Насиров И.Н., Гебель В.В. Оценка эффективности применения мультипотентных мезенхимальных клеток костного мозга для коррекции нарушений функции почек при остром отравлении. // Морфологические ведомости, 2013, №3, С. 43-45.
5.  Буреш Я.Н., Бурешова О.В. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. – М., «Высшая школа», 1991 – 400 с.
6. Егорова Г.М., Иванов Н.Г., Саноцкий И.В. В кн.: Токсикология новых промышленных химических веществ, в. 8, Л., 1966, 33.

References

1. Hodgetts SI, Stagg K, Sturm M, Edel M, Blancafort P. Long live thestem cell: the use of stem cells isolated from post mortem tissues for translational strategies. // Int J Biochem Cell Biol. 2014 Nov;56:74-81.
2. Latil M, Rocheteau P, Châtre L, Sanulli S, Mémet S, Ricchetti M, Tajbakhsh S, Chrétien F. Skeletal muscle stem cells adopt a dormant cell state post mortem and retain regenerative capacity. // Nat Commun. 2012 Jun 12;3:903.
3. Perán M, López-Ruiz E, González-Herrera L, Bustamante M, Valenzuela A, Marchal J.A. Cellular extracts from post-mortem human cardiac tissue direct cardiomyogenic differentiation of human adipose tissue-derived stem cells. // Cytotherapy. 2013 Dec;15(12):1541-8.
4. Zasorin B.V., Kurmangaliev O.M., Nasirov I.N., Gebel' V.V. Ocenka jeffektivnosti primenenija mul'tipotentnyh mezenhimal'nyh kletok kostnogo mozga dlja korrekcii narushenij funkcii pochek pri ostrom otravlenii. // Morfologicheskie vedomosti, 2013, №3, S. 43-45.
5. Buresh Ja.N., Bureshova O.V. Metodiki i osnovnye jeksperimenty po izucheniju mozga i povedenija. – M., «Vysshaja shkola», 1991 – 400 s.
6. Egorova G.M., Ivanov N.G., Sanockij I.V. V kn.: Toksikologija novyh promyshlennyh himicheskih veshhestv, v. 8, L., 1966, 33.