ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕБЕЛКОВОЙ ОРГАНИЧЕСКОЙ СОСТАВЛЯЮЩЕЙ И ЕЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПО ОБЪЕМУ МОЧЕВЫХ КАМНЕЙ

Антонова М.О.¹, Кузьмичева Г.М.², Руденко В.И.³

¹Аспирант; ²Доктор химических наук, профессор, Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова; ³Доктор медицинских наук, доцент, НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека, кафедра урологии Первого МГМУ имени И.М. Сеченова.

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕБЕЛКОВОЙ ОРГАНИЧЕСКОЙ СОСТАВЛЯЮЩЕЙ И ЕЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПО ОБЪЕМУ МОЧЕВЫХ КАМНЕЙ

Аннотация В работе показана возможность качественного и количественного (для ряда компонентов) определения небелковой органической составляющей мочевых камней (НОС) с использованием впервые примененного для этих целей метода газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором. Представлено распределение НОС по объему конкрементов и выявлена ее связь с видом мочевых камней.

Ключевые слова: мочевые камни, небелковые органические компоненты, газовая хроматография.

Antonova M.O.¹, Kuz’micheva G.M.², Rudenko V.I.³

¹postgraduate student; ² Dr.of Science in chemistry, Professor, Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technology; ³ Dr.of Science in medicine, Associate Professor, Research Institute Uronephrology and Reproductive Health, Department of urology of Sechenov First Moscow State Medical University

USING OF GAZ CHROMATOGRAPHY FOR DETERMINATION OF URINARY STONES NON-PROTEIN ORGANIC COMPONENTS AND THEIR DISTRIBUTION IN THEIR VOLUME

Abstract This paper shows the possibility of qualitative and quantitative (for a number of components) of the definition of non-protein organic component of urinary stones using in first time gas chromatography with flame ionization detector. The distribution of non-protein organic component by stones volume has been submitted and their relationship with forms of urinary stones has been revealed.

Keywords: urinary stones, organic non-protein components, gas chromatography.

ВВЕДЕНИЕ

Мочекаменная болезнь (МКБ) занимает одно из первых мест среди урологических заболеваний, встречается не менее чем у 3% населения, составляя в среднем по России 34.2%. Наблюдаемая в настоящее время тенденция к междисциплинарности в решении имеющихся проблем в каждой области знания не обошла и урологию. Выбор метода лечения МКБ и метафилактических мероприятий напрямую зависит от состава и строения мочевых камней, состава мочи, в которой произошло их образования и рост, и связи между ними.

В состав мочевых камней помимо неорганических соединений (оксалаты, фосфаты, ураты и другие) входят органические компоненты, которые представлены белками [1-5], гликопротеидами и полисахаридами [1]. Все перечисленные органические вещества (белки, гликопротеиды и полисахариды) активно участвуют в камнеобразовании (ингибиторы или катализаторы роста мочевых камней) [1-3] и формировании их макро- и микроструктуры [1, 2]. Количество белка сильно варьируется в различных типах камней: их доля в фосфатных образованиях может составлять до десятков процентов от общей массы, в оксалатных камнях содержание белковых веществ ниже, а в уратных, как правило, ничтожно мало [2-5]. По данным [4, 5] известно, что для оксалатов и уратов характерно большее количество белка в центральной части камня, а для фосфатов на периферии.

Установлено, что белки влияют на твердость уролитов (для твердых камней характерно низкое содержание белка) [4, 5]. От твердости камня зависит выбор метода лечения: открытая операция, дистанционная ударно-волновая литотрипсия и др. Для выбора метода лечения в медицинской практике применяется метод мультиспиральной компьютерной томографии (МСКТ), который позволяет определить плотность камня. Авторами [6] найдено, что плотность камня определенной in vivo по данным МСКТ пропорциональна твердости камня, оцененной in vitro.

Все перечисленные компоненты (белки, гликопротеиды и полисахариды) попадают в мочевые камни из мочи в процессе их роста. Однако в состав мочи входит и ряд небелковых органических компонентов, в частности, предельные углеводороды, их спирты, кетоны и кислоты, являющиеся продуктами нормальных процессов жизнедеятельности (метаболизма) организма человека. Данные вещества попадают в камень из мочи и являются показателем какого-либо заболевания. Согласно [7], наличие кетонов в составе суточной мочи в количестве более 50 мг может свидетельствовать о сахарном диабете или онкологических заболеваниях; ацетон является продуктом окисления жиров и частичного окисления белков при недостатке углеводов в организме; ацетальдегид взаимодействует с белками и аминокислотами в печени и является продуктом нарушения белкового обмена; пропан-2-ол – продукт метаболизма жиров и углеводов.

Известные на сегодняшний день методы исследования мочевых камней [1-6] не позволяют оценить небелковые компоненты в их составе, поэтому мы воспользовались методом газовой хроматографии (ГХ), который дает возможность определять предельные углеводороды, спирты, альдегиды и кетоны в составе биологических материалов [8]. Для детектирования перечисленных соединений наиболее целесообразно применение пламенно-ионизационного детектора (ПИД), так как в данном случае он не уступает по чувствительности масс-спектрометрическому (МС) и является более дешевым.

Цель работы – применение метода газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором для определения небелковых органических компонентов в составе мочевых камней.

МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

Метод газовой хроматографии.

Для анализа использовался Хроматограф Кристалл-2000М с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой ZB-5, длиной 30 м. диаметром 0,32 мм и толщиной слоя жидкой неподвижной фазы (5% фенилполисилоксана и 95% диметилполисилоксана) - 0,5 мкм. Используемый расход газа-носителя: водород - 20 мл/мин; воздух - 200 мл/мин; азот - 0,7 мл/мин, сброс - 21 мл/мин, деление потока - 1:30; линейная скорость азота через колонку при 40 ˚С - 25,286 см/сек. Нагрев колонки: 40˚С - изотерма 5 мин., далее нагрев до 300 ˚С со скоростью 10 ˚С/мин.

Подготовка образцов к анализу.

Мочевые камни, выбранные для исследования, измельчались в ступке, затем помещались в незаполненную стеклянную трубку-пробоотборник от штатного устройства для ввода проб воздуха в хроматограф (внешний дозатор крепился к испарителю). На конец трубки крепились заглушки из стекловаты, предварительно продутые около 1 часа азотом при 300 ˚С.

Ввод пробы осуществлялся в два приема:  

1. Проба термостатируется 1 мин при 100 ˚С или 150 ˚С, азот поступает в колонку минуя пробоотборник.
2. Через трёхходовой кран азот поступает в пробоотборник и далее в колонку. Одновременно с переводом направления азота производится запуск программы хроматографа.

При исследовании состава уратного мочевого камня пошагово (по 4 точкам от центра к периферии) при двух температурах десорбции (100 °С и 150 °С) оказалось, что наиболее подходящей является десорбция до 100 °С, т.к. при повышении температуры более летучие компоненты (ацетон, этанол, пропан-2-ол) не детектируются.

Количественный анализ ацетальдегида, ацетона и пропан-2-ола проводился по методу внешнего стандарта: площадь пиков, характерных для этих веществ на хроматограмме мочевого камня сравнивалась с площадью пиков этих веществ на хроматограмме стандартной смеси, содержащей по 10 мкг/г каждого компонента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

С применентем метода (ГХ-ПИД) в составе мочевых камней найдены ацетальдегид, ацетон, пропан-2-ол, бутан-1-ол, пропионовая кислота, уксусная кислота, этанол, причем бутан-1-ол присутствует во всех видах камней (таблица).

Таблица 1. Содержание небелковых органических компонентов в камнях различного состава.

Состав камня	Оксалат
	Вевеллит*	Ведделлит*
Небелковые органические компоненты, мкг/г	ацетальдегид~ 1.56	ацетальдегид ~ 0.24
	ацетон ~1.02	ацетон ~1.27
		пропан-2-ол ~ 0.05
	бутан-1-ол	бутан-1-ол
	пропионовая кислота
	уксусная кислота	уксусная кислота
	этанол	этанол
Состав камня	Фосфат
	Карбонатгидроксилапатит (43%) + Струвит (57%)*
Небелковые органические компоненты, мкг/г	пропан-2-ол ~ 0.85
	бутан-1-ол
Состав камня	Урат
	Мочевая кислота (68%) + Дигидрат мочевой кислоты (32%)*
Небелковые органические компоненты, мкг/г	ацетальдегид ~ 5.56
	ацетон ~ 2.98
	пропан-2-ол ~ 0.18
	бутан-1-ол
	пропионовая кислота
	уксусная кислота
	этанол

* состав мочевого камня определен по результатам рентгенографического эксперимента [4-6].

Из таблицы видно, что для оксалатов характерно отсутствие пропан-2-ола (ведделлит) и пропионовой кислоты (вевеллит). Для уратов найдено, что в безводной мочевой кислоте присутствует весь набор компонентов кроме пропионовой кислоты, а в дигидрате мочевой кислоты отсутствует пропан-2-ол. Для фосфатов характерен только пропан-2-ол и бутан-1-ол.

В результате исследования уратного мочевого камня по 4 точкам, крайние из которых центр и периферия, установлено, что содержание компонентов по объему кристалла (от периферии к центру) меняется неравномерно: на периферии камня преобладают изобутанол и ацетальдегид, а в центре – бутан-1-ол, ацетон и пропан-2-ол. На рис. 1 представлено изменение количества ацетальдегида, ацетона и пропан-2-ола от периферии к центру составе этого камня (табл.).

Рис. 1. Изменение содержания небелковых органических компонентов от периферии к центру мочевого камня (урата)

Как видно из полученных данных, в процессе роста камня значительно увеличивается количество ацетальдегида, а количество ацетона и пропан-2-ола уменьшается. Эти жидкие небелковые органические вещества диффундируют в мочевые камни из мочи, проникая внутрь через поры, и в отличие от белка по-иному распределяются по камням разного типа (рис. 2): наибольшее их количество (в частности, ацетальдегид, ацетон, пропан-2-ол) содержится в уратах (рис. 2).

Рис. 2. Общее количество небелковых органических компонентов в камнях различного состава.

Это, вероятно, связано с тем, что эти вещества, имея короткую углеродную цепь, легко диффундируют в поры уратов и предопределяют возможность разрушения камней под действием жидкостей (лекарственные препараты, минеральная вода, и др.)

На основании этих данных и результатов анализа камней на содержание небелковых органических компонентов (ацетона, ацетальдегида и пропан-2-ола) можно и выбирать медикаментозное лечение для предотвращения повторного камнеобразования. Действительно, модельная оценка влияния минеральной воды «Фьюджи» на уратный и фосфатный мочевые камни, проведенная in vitro, показала, что при нахождении в воде в течение 7 дней уратный камень полностью разрушился, а фосфатный разрушился лишь частично.

ВЫВОДЫ:

Впервые применен метод газовой хроматографии для качественного и количественного (ряда компонентов) определения органических веществ небелковой природы в составе мочевых камней.

Установлено, что наибольшее количество небелковых органических компонентов (ацетон, ацетальдегид, пропан-2-ол) содержится в уратах, что позволяет предложить возможные способы их разрушения.