МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В СЫРЬЕ СТЕВИИ РЕБО
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В СЫРЬЕ СТЕВИИ РЕБО
Аннотация
Целью данной работы явилось качественное и количественное изучение флавоноидных соединений листьев стевии Ребо. Объектом для исследования служили листья стевии Ребо, собранные на территории РФ, Индии и Парагвая. Растительный материал был высушен воздушно-теневым способом. Проведено количественное определение суммы флавоноидов в стевии листьях методом дифференциальной спектрофотометрии. Для подтверждения наличия флавоноидов в стевии листьях использовали тонкослойную хроматографию. Методом дифференциальной спектрофотометрии в экстрактах из листьев стевии Ребо подтверждено наличие флавоноидов, определены аналитические максимумы исследуемых соединений 400±2 нм. Обоснованы оптимальные условия экстракции флавоноидов из сырья данного растения (экстрагент – спирт этиловый 70%; соотношение «сырье – экстрагент» - 1:100; время экстракции – 45 минут; степень измельченности сырья – 2,0 мм).
1. Введение
В медицинской практике многих стран сырье стевии Ребо (Stevia rebaudiana Bertoni, сем. Астровые – Asteraceae) применяется в качестве антидиабетического средства. По литературным данным продукты на основе растения стевия Ребо обладают гипотензивным, адаптогенным, гипогликемическим, антимикробным, антиоксидантным действиями [1], [5], [15], [16].
Актуальной проблемой является выработка эффективных стандартов относительно лекарственного сырья из стевии Ребо для нужд фармацевтической промышленности. В листовых пластинках стевии содержатся дитерпеновые гликозиды, флавоноиды, фенилпропаноиды, сапонины [2], [4], [6], [11]. Однако химический состав разновидностей стевии недостаточно изучен. В процессе практического выявления, в том числе количественным способом, флавоноидов в растительном сырье принято использовать те или иные методики спектрофотометрии [7], [10], [12], [14]. Данные методы отличаются простотой, быстротой и удобством, отсутствует необходимость использования дорогостоящей техники.
2. Методы и принципы исследования
Субстратом для исследовательской работы послужили подвергнутые сушке листовые пластинки стевии Ребо (Stevia rebaudiana Bertoni). Происхождение сырья – Пензенская, Тверская области, Краснодарский край, Республика Крым, а также импорт из Парагвая и Индии.
С целью установления факта наличия флавоноидов в исследуемых образцах применялся метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) [7], [8], [9], [10]. На линию старта хроматографической пластинки, которая была приведена в активное состояние в сушильном шкафу при температуре 100-105 оС, с помощью пипетки было нанесено 0,02 мкл водно-спиртового экстракта из листовых пластинок стевии Ребо. При этом веществами-свидетелями выступали спиртовые растворы стандартных образцов (СО) цинарозида, лютеолина, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, рутина, гиперозида, кверцетина. В дальнейшем хроматографическую пластинку располагали в камеру для хроматографии. В последней была создана атмосфера с высоким содержанием испаренных растворителей. Выдержка составляла 1 сутки. Собственно процесс тонкослойной хроматографии производился восходящим методом по формуле хлороформ – этиловый спирт 70 % – вода (26:16:3) на стандартных хроматографических пластинках «Сорбфил-ПТСХ-АФ-Ф-УФ». После того как фронт растворителя проходил около 8 см, используемую пластинку извлекали из рабочей камеры, высушивали и детектировали зоны веществ. Получившиеся хроматограммы изучались в условиях естественного освещения, в ультрафиолетовом спектре при длинах волн равных 366 и 254 нм, проводилась спектрофотометрия. Кроме этого, полученные хроматограммы подвергались воздействию щелочного раствора ДСК и фосфорно-молибденовой кислоты.
Содержание суммы флавоноидов оценивали методом дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на цинарозид [8], [9]. Для измерений на спектрофотометре СФ-200 использовали кварцевые кюветы с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Спектры собственного поглощения флавоноидов листьев стевии регистрировали в интервале длин волн 200 - 500 нм. Для количественного определения флавоноидов в извлечениях из листьев стевии применяли метод дифференциальной спектрофотометрии. Статистическую обработку осуществляли по методике, описанной в ГФ XIII. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в процентах (Х) вычисляли по формуле:
где:
A –оптическая плотность раствора;
350 –удельный показатель поглощения цинарозида с алюминия хлоридом при длине волны 400 нм;
а – навеска сырья, г;
W –влажность сырья, %.
3. Основные результаты и обсуждение
Итогом проведенного анализа с использованием метода тонкослойной хроматографии (ТСХ) стал факт доминирования в листовых пластинках стевии Ребо такого флавоноида как цинарозид. На полученной в результате исследования хроматограмме заметно, что присутствует ярко выраженная область оранжевого оттенка Rf (фактор удерживания) в районе 0,55 на уровне стандартного образца хлорогеновой кислоты. Также на полученной хроматограмме видна область желтого оттенка с Rf (фактор удерживания) в районе 0,64 на уровне стандартного образца цинарозида (рис.2). Следовательно, наиболее практичным способом осуществления качественного исследования листовых пластинок стевии Ребо и веществ на их основе методом ТСХ является применение вещества-стандарта цинарозида с целью подсчета величин Rf.
В соответствии с данными литературы, можно сказать, что цинарозид характерен для сырья многих представителей семейства сложноцветные (пижма, одуванчик, расторопша др.) [8], [9].
Рисунок 1 - Схема хроматограммы извлечения из стевии листьев. Система хлороформ – этиловый спирт 70 % – вода (26:16:3):
1 – извлечение из стевии листьев (1:50); 2- СО цинарозида, 3 - СО лютеолина; 4 - СО кофейной кислоты; 5 - СО хлорогеновой кислоты; 6 - СО рутина; 7 - СО гиперозида; 8 - СО кверцетина
Таблица 1 - Зависимость выхода флавоноидов листьев стевии от концентрации экстрагента
№ п\п | Сорт стевии, место произрастания | Спирт этиловый, % | Содержание флавоноидов, % (по СО цинарозида) | Содержание флавоноидов, % (по удельному показателю поглощения цинарозида при (λ= 400 нм) |
1 | Рамонская сластена (Россия, Краснодар) | 40 | 1,24 ±0,03 | 1,21 ±0,03 |
2 | Рамонская сластена (Россия, Краснодар) | 70 | 1,74 ±0,02 | 1,71 ±0,02 |
3 | Рамонская сластена (Россия, Краснодар) | 95 | 1,69 ±0,04 | 1,66 ±0,04 |
При исследовании влияния, различных параметров экстракции на выход действующих веществ, нами были получены следующие результаты (таб. 2).
Таблица 2 - Влияние различных факторов на полноту извлечения флавоноидов
Экстрагент | Соотношение «сырье – экстрагент» | Степень измельченности, мм | Время экстракции, мин | Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид, % |
Влияние соотношения «сырье – экстрагент» | ||||
Спирт 70 % | 1:25 | 1 | 45 | 1,46 ± 0,10 |
Спирт 70 % | 1:100 | 1 | 45 | 1,70 ± 0,03 |
Спирт 70 % | 1:200 | 1 | 45 | 1,53 ± 0,06 |
Влияние степени измельченности | ||||
Спирт 70 % | 1:100 | 1 | 45 | 1,70 ± 0,03 |
Спирт 70 % | 1:100 | 2 | 45 | 1,74 ± 0,03 |
Спирт 70 % | 1:100 | 3 | 45 | 1,61 ± 0,03 |
Влияние времени экстрагирования | ||||
Спирт 70 % | 1:100 | 2 | 45 | 1,74 ± 0,05 |
Спирт 70 % | 1:100 | 2 | 90 | 1,57 ± 0,03 |
Спирт 70 % | 1:100 | 2 | 120 | 1,51 ± 0,09 |
С целью разработки проекта методики количественного определения суммы флавоноидов определены оптимальные условия экстракции:
экстрагент – спирт этиловый 70%;
соотношение «сырье – экстрагент» - 1:100;
время экстракции – 45 минут;
степень измельченности сырья – 2 мм.
Следует отметить, что, по нашим данным, степень измельчения от 1 до 3 мм сильного влияния на экстракцию не оказывает. В качестве оптимальной нами выбрана степень измельчения 2 мм.
Количественное определение содержания флавоноидов основано на химической реакции комплексообразования с хлоридом алюминия [5], [6], [7] ,[8]. В процессе данной реакции происходит батохромный сдвиг полосы поглощения флавоноидов. Последний успешно детектируется в ультрафиолетовом спектре как максимальное значение поглощения на длинах волн от 380 до 412 нм [5], [7], [8]. Проведенное практическое исследование позволило выявить, что в присутствии хлорида алюминия максимальное значение поглощения продукта реакции комплексообразования с участием флавоноидов стевии приходится на длину волны 400±2 нм.
Рисунок 2 - УФ спектр водно-спиртового извлечения стевии листьев:
1 – исходный раствор (1:5000); 2 – раствор в присутствии AlCl3
Рисунок 4 - Электронные спектры раствора цинарозида в присутствии AlCl3
Рисунок 5 - УФ-спектр извлечения из стевии листьев (1:1250) в присутствии AlCl3
В нашей работе в качестве стандарта был использован цинарозид, который с хлоридом алюминия имеет максимум при 400 ±2 нм (рис. 3) и также используется в методиках анализа сырья, содержащего флавоноиды [7], [9], [10], [14]. Следовательно, извлечение из листьев стевии и цинарозид по спектральным характеристикам близки, и цинарозид может быть использован в методике количественного определения в качестве стандарта.
Максимальное количество флавоноидов из листьев стевии в оптимальных условиях составило 1,74% весовых, что позволяет поставить это растение по содержанию флавоноидов в один ряд с уже используемыми лекарственными растениями – источниками флавоноидов (табл.3).
Для того чтобы предлагаемая методика заняла достойное место при определении качества листьев стевии, были определены метрологические характеристики, ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет не более ± 1,39 % (табл.3). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки используемой нами методики.
Таблица 3 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях стевии
Лекарственное растительное сырье | N | F | Х | S2 | S | P, % | t (P, f) | ∆Х | E, % |
Рамонская сластена (Краснодар) | 5 | 4 | 1,74 | 0,00032 | 0,017889 | 95 | 2,776 | ±0,016 | ±0,50 |
Рамонская сластена (Тверь) | 5 | 4 | 1,38 | 0,00025 | 0,015811 | 95 | 2,776 | ±0,014 | ±0,51 |
Рамонская сластена (Пенза) | 5 | 4 | 1,59 | 0,00113 | 0,033615 | 95 | 2,776 | ±0,029 | ±1,01 |
София (Пенза) | 5 | 4 | 1,47 | 0,00092 | 0,030332 | 95 | 2,776 | ±0,027 | ±1,03 |
Стевия (Парагвай) | 5 | 4 | 1,42 | 0,00053 | 0,023022 | 95 | 2,776 | ±0,020 | ±0,80 |
Стевия (Индия) | 5 | 4 | 1,13 | 0,00097 | 0,031145 | 95 | 2,776 | ±0,027 | ±1,39 |
Рамонская сластена (Крым) | 5 | 4 | 1,52 | 0,00157 | 0,039623 | 95 | 2,776 | ±0,034 | ±1,37 |
Примечание: N - число независимых параллельных определений; X- среднее значение определяемой величины; S2- средняя квадратичная ошибка; S - стандартное отклонение; P - доверительная вероятность; t (P, f) - критерий Стьюдента; ∆Х - полуширина доверительного интервала; E - относительная ошибка среднего результата
4. Заключение
Установлены оптимальные условия методики экстракции стевии листьев:
- экстрагент – 70% спирт этиловый;
- соотношение «сырье и экстрагент» – 1: 100;
- степень измельченности сырья – 2 мм;
- время экстракции – 45 мин.
Определено, что в листьях стевии содержится до 1,74% суммы флавоноидов.
Полученные результаты доказывают, что листья стевии являются перспективным лекарственным растением, и являются ценным источником флавоноидов. Целесообразно дальнейшее изучение для разработки нормативных документов.