A NEW LOW-TOXIC FORM OF THE MONOETHANOLAMINE SALT OF ELTROMBOPAG AS A THROMBOPOIETIN RECEPTOR AGONIST
A NEW LOW-TOXIC FORM OF THE MONOETHANOLAMINE SALT OF ELTROMBOPAG AS A THROMBOPOIETIN RECEPTOR AGONIST
Abstract
Relevance. Eltrombopag is a thrompoietin receptor agonist intended for long-term use. In commercial drugs, it is supplied as a bis-(monoethanolamine) salt. Monoethanolamine is low in toxicity, but with long-term use it accumulates in the body and creates an additional drug load.
Objective: to evaluate the reduction in toxicity of a pharmaceutical composition based on a new crystalline form of monoethanolamine eltrombopag (MEAE, Form B) compared with the known bis-(monoethanolamine) salt (DEAE).
Methods: obtaining form B, X-ray diffraction analysis, NMR spectroscopy, determination of acute toxicity (LD₅₀) in animals, bioequivalence study, comparative stability of crystalline forms (B, H, E) at 40°C and 75% humidity.
Results: The LD50 for the MEAE-based drug (form B) was 4,242 mg/kg, and for the DEAE-based drug it was 3,340 mg/kg (a reduction in toxicity of ~27 %) The drugs are bioequivalent (90% CI for AUC0-t: 85.05–105.62%). The stability of the formulation at 40°C and 75% relative humidity is maintained for up to 137 days (form E — 68 days, form H — 46 days).
Conclusion: The use of the new form of MEAE reduces the drug load on the body by lowering the monoethanolamine content in the active substance molecule without compromising efficacy.
1. Введение
Безопасность лекарственных препаратов (ЛП) является приоритетом здравоохранения. Безопасность ЛП — это характеристика ЛП, основанная на сравнительном анализе эффективности применения и риске вреда здоровью, т.е. риска развития у него нежелательных, в том числе токсических, эффектов .
Особое значение это приобретает для препаратов длительного применения, к которым относится элтромбопаг (агонист рецептора тромбопоэтина).
3'-[(2Z)-2-[1-(3,4-диметилфенил)-1,5-дигидро-3-метил-5-оксо-4Н-пиразол-4-илиден]гидразино]-2'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоновая кислота (элтромбопаг основание, ЭО) (рис. 1) обладает свойствами агониста рецептора тромбопоэтина и может применяться, в частности, для усиления продуцирования тромбоцитов и лечения тромбоцитопении.
![Структурная формула 3'-[(2Z)-2-[1-(3,4-диметилфенил)-1,5-дигидро-3-метил-5-оксо-4Н-пиразол-4-илиден]гидразино]-2'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты](/media/images/2026-05-18/f3022597-df85-40f9-9881-6006bf8bca31.png)
Рисунок 1 - Структурная формула 3'-[(2Z)-2-[1-(3,4-диметилфенил)-1,5-дигидро-3-метил-5-оксо-4Н-пиразол-4-илиден]гидразино]-2'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты
Указанная тромбоцитопения может быть обусловлена угнетением спинного мозга, вызванным химиотерапией или лучевой терапией, трансплантацией органа, трансплантантом костного мозга, стволовых клеток или печени, идиопатической тромбоцитопенической пурпурой, миелодиспластическими синдромами, апластической анемией или лейкемией, вирусной, грибковой, микробной или паразитарной инфекцией, дисфункцией печени, хирургическими операциями, а также лечением противовирусными средствами или антибиотиками.
ЭО является веществом, мало растворимым в воде в соответствии с ОФС.1.2.1.0005.15 Растворимость. Малая растворимость оказывает негативное влияние на возможность разработки и внедрения лекарственных препаратов на основе ЭО и снижает биологическую доступность .
Известно применение фармацевтической композиции (ФК) на основе бис-(моноэтаноламин) 3'-[(2Z)-[1-(3,4-диметилфенил)-1,5-дигидро-3-метил-5-оксо-4Н-пиразол-4-илиден]гидразино]-2'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (ДЭАЭ)
(рис. 2) в готовом лекарственном препарате. ДЭАЭ имеет лучшую растворимость, чем ЭО, что делает ее более биологически доступной.![Структурная формула бис-(моноэтаноламин) 3'-[(2Z)-[1-(3,4-диметилфенил)-1,5-дигидро-3-метил-5-оксо-4Н-пиразол-4-илиден]гидразино]-2'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты](/media/images/2026-08-26/0d8c0657-76ac-474b-98c7-3662aa578a86.png)
Структурная формула бис-(моноэтаноламин) 3'-[(2Z)-[1-(3,4-диметилфенил)-1,5-дигидро-3-метил-5-оксо-4Н-пиразол-4-илиден]гидразино]-2'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты
Содержание в ДЭАЭ двух молекулы моноэтаноламина (МЭА) на одну молекулу активного основания может приводить к побочным реакциям организма пациента при приеме препарата. МЭА, хотя и малотоксичен, способен накапливаться в организме при длительном введении . Снижение его содержания в лекарственной форме может уменьшать суммарную токсическую нагрузку.
Известны методы, которые используются для снижения такой нагрузки, например, введением углеводных остатков в структуру биологически активных соединений . Однако это значительно усложняет и технологию производства, и контроль качества ГЛФ.
Другое решение — это поиск новых фармацевтически приемлемых форм биологически активного вещества с новыми физико-химическими свойствами.
Учитывая, что элтромбопаг относится к препаратам, применение которых жизненно необходимо постоянно, концентрация МЭА в организме будет величиной постоянной. Снижение его концентрации в ГЛФ будет способствовать уменьшению данной концентрации, и, следовательно, уменьшению токсической нагрузки.
В настоящем исследовании в качестве активного вещества для фармацевтической композиции предложено использование 3'-[(2Z)-2-[1-(3,4-диметилфенил)-1,5-дигидро-3-метил-5-оксо-4Н-пиразол-4-илиден]гидразино]-2'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоновая кислота в виде моноэтаноламиновой соли (рис. 3) (МЭАЭ).
![Структурная формула моноэтаноламин 3'-[(2Z)-[1-(3,4-диметилфенил)-1,5-дигидро-3-метил-5-оксо-4Н-пиразол-4-илиден]гидразино]-2'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты](/media/images/2026-08-26/13b36484-fb03-499c-b046-23bcee434123.png)
Структурная формула моноэтаноламин 3'-[(2Z)-[1-(3,4-диметилфенил)-1,5-дигидро-3-метил-5-оксо-4Н-пиразол-4-илиден]гидразино]-2'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты
В литературе описаны кристаллические формы МЭАЭ: форма H, характеризующаяся дифрактограммой, содержащей пики при 4,9, 6,9, 15,1 и 23,0 +(-) 0,2° 2θ, а также 9,9, 12,7, 24,0 и 27,1+(-) 0,2° 2θ и форма E, характеризующаяся дифрактограммой, содержащей пики при 10,5, 13,4, 19,5 и 21,7 +(-) 0,2° 2θ, а также 8,3, 14,1, 18,3, 25,5 и 26,4+(-) 0,2° 2θ
.Цель настоящего исследования — экспериментально доказать, что новая, ранее неизвестная кристаллическая форма моноэтаноламин 3'-[(2Z)-[1-(3,4-диметилфенил)-1,5-дигидро-3-метил-5-оксо-4Н-пиразол-4-илиден]гидразино]-2'-гидрокси-[1,1'-бифенил]-3-карбоновой кислоты (МЭАЭ, форма В) обеспечивает меньшую токсичность по сравнению с ДЭАЭ при сохранении биоэквивалентности и приемлемой стабильности.
2. Материалы и методы
МЭАЭ был получен по методу, описанному в кристаллизацией из смеси ДМФА-этилацетат в виде неизвестной ранее кристаллической формы В. Выход 92%. Структура подтверждена 1H-ЯМР- и 13C-ЯМР-спектрами (соотношение МЭА:элтромбопаг = 1:1). Кристаллическая форма В идентифицирована по характерным пикам: 6,5; 10,9; 11,1; 11,4; 14,2; 14,6; 15,4; 16,7; 21,7; 24,5; 25,8; 26,1; 26,3; 29,1°2θ (±0,2) (табл. 1).
Таблица 1 - Положения и интенсивности основных пиков МЭАЭ, форма B
20, ° | d, Å | Относительная интенсивность, % | 20, ° | d, Å | Относительная интенсивность, % |
6,508 | 13,57154 | 18,80 | 20,961 | 4,23471 | 4,40 |
8,248 | 10,71058 | 4,80 | 21,241 | 4,17957 | 3,30 |
9,565 | 9,23871 | 5,50 | 21,735 | 4,08569 | 34,50 |
10,933 | 8,08606 | 28,90 | 22,39 | 3,96763 | 6,60 |
11,126 | 7,94615 | 68,00 | 22,625 | 3,92694 | 11,00 |
11,422 | 7,74058 | 13,40 | 23,875 | 3,72399 | 3,90 |
12,786 | 6,91813 | 6,20 | 24,236 | 3,66944 | 3,70 |
13,060 | 6,77343 | 4,00 | 24,460 | 3,63628 | 14,70 |
14,172 | 6,24442 | 76,80 | 25,119 | 3,54233 | 10,70 |
14,629 | 6,05023 | 15,30 | 25,335 | 3,51264 | 10,20 |
15,394 | 5,75142 | 36,10 | 25,767 | 3,45469 | 100,00 |
16,552 | 5,35139 | 7,80 | 26,081 | 3,41382 | 12,80 |
16,692 | 5,30679 | 14,60 | 26,332 | 3,38186 | 33,80 |
17,264 | 5,1324 | 3,80 | 27,069 | 3,29142 | 4,00 |
18,706 | 4,7398 | 3,90 | 27,423 | 3,24976 | 6,90 |
19,204 | 4,61805 | 2,00 | 29,090 | 3,0672 | 20,80 |
19,656 | 4,5128 | 3,50 | 31,036 | 2,87916 | 7,10 |
19,916 | 4,45442 | 5,10 |
|
|
|
Характеристика кристаллического состава полученного соединения определялась с помощью рентгенофазного анализа. Съемка образца проводилась на порошковом рентгеновском дифрактометре Bruker D8 Advance Vario (медное излучение Cu-Kα1=1.54060 Å) с Ge(111) монохроматором и позиционно-чувствительным детектором LynxEye, θ/2θ геометрия, интервал съемки 2.0°-60°, шаг 0.02° с вращением.
Структура полученного соединения была доказана с помощью ЯМР-спектроскопии. 1H-ЯМР-спектр и 13C-ЯМР-спектр были записаны на ЯМР-спектрометре Avance 400 МГц. Образец был приготовлен путем растворения 10 мг вещества в ДМСО-d (99,8% атомов D, «Мерк»), высота столба жидкости в пробирке 4 см.
Кристаллическая форма H и кристаллическая форма E были получены по методу
.Стабильность форм МЭАЭ (форма В и форм Н и Е) была изучена при температуре 40 °С и влажности 75% на протяжении продолжительного времени в климатической камере Memmert HP260 до появления изменений на дифрактограмме.
ДЭАЭ был получен по методу
.Сравнительное исследование острой токсичности выполнено на двух группах животных (n=18, перекрестный дизайн) с определением LD50 по методу
. Исследуемый препарат — таблетки с МЭАЭ (56,9 мг, экв. 50 мг элтромбопага). Препарат сравнения – таблетки с ДЭАЭ (63,8 мг, экв. 50 мг элтромбопага).Биоэквивалентность определяли концентрацию элтромбопага в плазме крови собак (отбор до и через 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 6; 8; 12; 24; 48; 72 ч) методом ВЭЖХ-МС
. Параметры AUC0-t, Cmax, Cmax/AUC0-t оценивали с 90% доверительными интервалами (допустимый диапазон 80–125%).3. Результаты
МЭАЭ был получен в форме B с чистотой 99,7%, Тпл = 237 ℃.
Структура полученной МЭАЭ доказана 1H-ЯМР-спектром (рис. 4, табл. 2) и 13C-ЯМР-спектром (рис. 5, табл. 3).
Рисунок 4 - 1H-ЯМР-спектр
Таблица 2 - 1H-ЯМР-анализ
δ, ppm. | Мультиплетность | Количество протонов | Отнесение сигналов | № атома |
2,19 | с | 3 | протоны метильной группы | 31 |
2,24 | с | 3 | протоны метильной группы | 32 |
2,35 | уш | 3 | протоны метильной группы | 24 |
2,88 | т | 2 | протоны метиленовой группы | 35 |
3,61 | т | 2 | протоны метиленовой группы | 36 |
6,96 | т | 1 | протон бензольного кольца | 27 |
7,09 | уш | 2 | протоны бензольного кольца | 13,26 |
7,49 | т | 2 | протоны бензольного кольца | 12,30 |
7,76 | м | 3 | протоны бензольного кольца | 2,3,11 |
7,89 | д | 1 | протон бензольного кольца | 4 |
8,20 | с | 1 | протон бензольного кольца | 6 |
Рисунок 5 - 13C-ЯМР-спектр
Таблица 3 - 13C-ЯМР-анализ
δ, ppm. | № атома |
20,2 | 27, 28 |
58,1 | 16 |
119,2 | 15 |
126,8 | 24 |
128,4 | 2, 11 |
129,9 | 4, 9 |
130,0 | 6, 13 |
130,3 | 1, 10 |
130,4 | 3, 12 |
132,5 | 5 |
132,6 | 21 |
169.5 | 23, 25 |
169,2 | 17 |
Соотношения протонов этаноламина к протонам ЭО показало, что на 1 моль ЭО приходится 1 моль этаноламина.
Полученная кристаллическая форма B МЭАЭ ранее не описана в литературе. На рис. 6 представлены данные рентгенофазного анализа.
Сравнение спектров дифрактограммы образца МЭАЭ формы B с данными, представленными в , показало наличие характеристических пиков 6,5; 10,9; 11,1; 11,4; 14,2; 14,6; 15,4; 16,7; 21,7; 24,5; 25,8; 26,1; 26,3; 29,1 +(-)0,2° 2θ, которые отсутствуют для кристаллических форм Н и Е.
Рисунок 6 - Дифрактограмма образца кристаллической формы B
Результаты определения острой токсичности приведены в таблице 4.
LD50 для препарата на основе новой формы В МЭАЭ оказалась на 27% выше, чем для ДЭАЭ (p<0,05). Это означает, что для достижения летального эффекта требуется существенно большая доза, т.е. новый препарат объективно безопаснее.
Таблица 4 - Острая токсичность препаратов на основе МЭАЭ и ДЭАЭ
Действующее вещество | LD50, мг/кг | 95% ДИ, мг/кг |
МЭАЭ (форма В) | 4242 | 3980 – 4520 |
ДЭАЭ | 3340 | 3110 – 3580 |
Биоэквивалентность
Таблица 5 - Описание биоаналитического метода и его основные метрологические характеристики
Аналитический метод | ВЭЖХ-МС/МС |
Тип калибровочной зависимости | Линейная зависимость |
Диапазон калибровочной кривой | От 8,8 нг/мл до 14644,7 нг в 1 мл плазмы |
Метод определения концентрации | Метод внутреннего стандарта по калибровочному графику |
Предел обнаружения | 2,9 нг в 1 мл плазмы |
Нижний предел количественного определения | 8,8 нг в 1 мл плазмы |
Биологическая матрица | Плазма крови собаки |
Количество животных | 18 |
Описательная статистика для рассчитанных фармакокинетических параметров проведена с использованием следующих показателей: среднее арифметическое, среднее геометрическое, стандартное отклонение, медиана, межквартильный размах, минимум, максимум, коэффициент вариации.
Все 90% доверительные интервалы для отношений AUC₀₋ₜ, Cmax и Cmax/AUC₀₋ₜ укладывались в диапазон 80–125% (табл. 6, рис. 7). Это полностью соответствует критериям биоэквивалентности.
Таблица 6 - Результаты анализа биоэквивалентности
Параметр | 90% доверительный интервал | Допустимый диапазон |
AUC₀₋ₜ | 85,05% – 105,62% | 80% – 125% |
Cmax | 84,70% – 97,08% | 80% – 125% |
Cmax/AUC₀₋ₜ | 85,74% – 106,76% | 80% – 125% |
Рисунок 7 - Усредненный график зависимости «концентрация-время» для 18 животных после приема исследуемого препарата и препарата сравнения в линейной системе координат
Стабильность кристаллических форм
Изучение стабильности показало неизменность дифрактограммы формы В в течение 137 суток в условиях ускоренного старения (40°C / 75% влажности). Для форм Е и Н — 68 суток и 46 суток, соответственно, (табл. 7).
Таблица 7 - Стабильность кристаллических форм МЭАЭ
Форма | Время до изменения РФА, сут |
В | 137 |
Е | 68 |
Н | 46 |
4. Обсуждение
Проведенные доклинические исследования токсилогической безопасности ФК, содержащей в качестве действующего вещества МЭАЭ (исследуемый препарат), в сравнение с ФК, содержащей в качестве действующего вещества ДЭАЭ показали перспективность применения МЭАЭ в качестве действующего вещества для лечения тромбоцитопении.
По данным исследования, полулетальная доза LD50 исследуемого препарата составила 4242 мг/кг, что почти на 27% выше данных для препарата сравнения — 3340 мг/кг. Выбор LD50 обусловлен максимальной статистической точностью, воспроизводимостью и меньшей вариабельностью данного показателя, что обеспечивает наиболее точную количественную оценку и стандартизированное сравнение токсичности веществ.
Исходя из этих данных, исследуемый препарат является менее токсичным по отношению к препарату сравнения, что позволяет говорить о снижении лекарственной нагрузки на организм пациента при использовании МЭАЭ.
Для доказательства, что МЭАЭ в виде формы B проявляет активность при меньшей токсичности, были проведены исследования биоэквивалентности ФК, содержащей в качестве действующего вещества МЭАЭ (исследуемый препарат) и ФК, содержащей в качестве действующего вещества ДЭАЭ у собак после однократного приема каждого из препаратов натощак.
Результаты анализа биоэквивалентности препаратов (табл. 6) и, учитывая, что 90% доверительные интервалы для отношений логарифмически преобразованных параметров AUC0-t, Cmax и Cmax/AUC0-t не выходят за установленные пределы, показали, что сравниваемые препараты являются биоэквивалентными.
Известно, что разные кристаллические формы одного вещества могут проявлять разные фармацевтические свойства . Для использования определенной формы вещества в ГЛФ, необходимо отсутствие не только химического распада вещества, но и фазовых переходов между различными формами.
Для установления срока годности ГЛФ из фармацевтических композиций на основе различных форм МЭАЭ (полученная нами форма В и форм Н и Е), была изучена стабильность самих форм. Результаты стабильности оценивали по критериям неизменности дифрактограммы кристаллических форм в начале исследования и по истечении установленного времени. Исследования проводились при температуре 40 °С и влажности 75%. Полученные результаты показали наличие разности в их поведении.
Как оказалось, только форма В сохраняет кристаллическую решетку без изменения вплоть до 137 суток в исследуемых условиях, а форма E и форма Н — 68 и 46 суток соответственно. Таким образом форма В более стабильна при хранении.
5. Заключение
1. Получена и охарактеризована новая кристаллическая форма В моноэтаноламиновой соли элтромбопага (МЭАЭ), ранее не описанная в литературе.
2. Острая токсичность препарата на основе формы В (LD50 = 4242 мг/кг) на 27% ниже, чем у препарата на основе бис-соли ДЭАЭ (3340 мг/кг).
3. Препараты биоэквивалентны: 90% доверительные интервалы для AUC₀₋ₜ, Cmax и Cmax/AUC₀₋ₜ находятся в пределах 80–125%.
4. Форма В превосходит по стабильности другие кристаллические формы МЭАЭ (Н и Е), сохраняя стабильную кристаллическую структуру не менее 137 суток в условиях 40°C/75% влажности.
5. Форма В МЭАЭ может быть использована в фармацевтических композициях — агонистах рецептора тромбопоэтина — для снижения лекарственной нагрузки при терапии тромбоцитопении.