CYTOKINE MARKERS IN INFECTIOUS ENDOCARDITIS

Инфекционный эндокардит (ИЭ) является заболеванием бактериальной природы, отмечается присутствие патогенов на эндокардиальной поверхности и клапанах сердца. Характеризуется прогрессирующим развитием сердечной недостаточности и эмболических проявлений [1]. Заболеваемость ИЭ в популяции составляет 1,5-11,6 случаев на 100 тыс. человек в год, при этом годичная смертность – до 40% [2]. Современный теоретический и практический опыт указывает на зависимость скорости распространения инфекционного процесса как от самого патогена, так и от состояния организма человека - от комплекса составляющих, а специфика развития и течение заболевания обусловлены состоянием иммунной системы индивидуума и чужеродностью возбудителя [3].

Нарушение межклеточного контакта, осуществляемое посредством цитокиновой сети, является важной составляющей патогенеза инфекционного процесса [4]. Цитокины, синтезируемые активированными клетками иммунной системы (ИС), представляют научный интерес со стороны объяснения изменений функциональной жизнеспособности иммунитета человека, дифференцировки степени тяжести заболевания, мониторинга эффективности терапии, прогноза развития и исхода состояния. Цитокины, участвуя в развитии воспаления, играют роль в изменении гемодинамических и микроциркуляторных показателей, а также в развитии отёка и гипоксии тканей. Особую роль отводят равновесию про- и противовоспалительных цитокинов, которое обуславливает течение, тяжесть и исход болезни [5]. ИЭ сопровождается постоянным присутствием патогенов в кровеносном русле, что влечёт к непрерывной активации иммунной системы, при этом сывороточные концентрации цитокинов увеличиваются и поддерживают воспалительные процессы всех стадий, что аргументирует необходимость их исследования для более детального понимания основ патогенеза заболеваний [4].

Так, цель исследования – оценка спектра про- и противовоспалительных цитокинов при инфекционном эндокардите и выявление наиболее диагностически значимых среди них.

Исследование реализовано с соблюдением норм добровольности и конфиденциальности, получено положительное заключение Независимого Этического Комитета ФГБОУ ВО КубГМУ МЗ РФ от 27.09.2019г., протокол №80. Все лица, принимающие участие в настоящем исследовании, были в полной мере осведомлены о целях и ходе проекта, получены письменные информированные согласия от всех участников.

Для реализации поставленной цели сформировали 2 группы:

1 – клиническая группа пациентов с ИЭ (n=119);

2 – группа контроля (n=20).

Пациенты – группа лиц, поступивших в кардиологические отделения «НИИ-ККБ№1» г. Краснодара по поводу установленного диагноза – ИЭ. Группа контроля – относительно здоровые лица, а именно – доноры, пришедшие в НИИ-ККБ№1 (г. Краснодар) на станцию переливания крови для сдачи материала, которые предварительно были осмотрены терапевтом и прошли стандартные лабораторные исследования. Обе группы, участвующие в исследовании, были сопоставимы по возрасту (пациенты - 52±11 лет, группа контроля - 53±10 лет). Критерии исключения: инфекционно-воспалительные, аутоиммунные, аллергические (в стадии обострения) заболевания, беременность, отсутствие письменного согласия, возраст <18 лет или >76 лет. В таблице №1 представлены основные характеристики пациентов с ИЭ.

Выполнено иммунологическое исследование для всех, 139 образцов сыворотки крови. Материал (венозная кровь) был набран в первый день, при поступлении пациентов в стационар. Концентрации сывороточных цитокинов (пг/мл) определяли посредством иммуноферментного анализа (ELISA). В исследование включены: интерлейкин (IL)-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17A, IL-18, антагонист рецептора IL-1 (IL-1Ra),

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics, версия 26. Описательная статистика представлена медианой (Me) и интерквартильным диапазоном (Q1-Q3), соответствующим 25 и 75 процентилю. Нормальность распределения признаков тестировали критерием Шапиро-Уилка. Для сравнения независимых групп использовали критерий Манна-Уитни (U). Метод бинарной логистической регрессии использовали для выявления наиболее значимых цитокиновых маркеров, с пошаговым включением последних. Пороговый уровень статистической значимости установлен при критическом значении вероятности p<0,05.

Для иммунологического исследования образцов крайне важно, чтобы материал был набран в первый день поступления пациента в стационар, поскольку проводимая агрессивная антибиотикотерапия и оперативное лечение влияют на ИС в целом и могут привести к неверной интерпретации результатов. Диагноз ИЭ всем пациентам устанавливался на основании критериев Duke [6], которые включают в себя клинические, лабораторные, инструментальные (ЭхоКГ и др.) и бактериологические (посев крови) методы. Так, спектр цитокинов был определён в сыворотке пациентов (n=119) с установленным диагнозом – ИЭ и в контрольной группе (n=20). Концентрации цитокиновых маркеров представлены в таблице №2.

Статистический анализ полученных данных позволил выявить значимые отличия (p<0,05) основной клинической группы пациентов от группы контроля по следующим цитокинам: IL-8, IFN-γ, IL-1Ra, IL-18, VEGF-А, IL-6 и IL-10. При этом согласно критерию Манна-Уитни, наибольшую значимую разницу при сравнении имели IL-8, IL-1Ra, IL-18, VEGF-А, IL-6 и IL-10. Тогда как IL-17A, TNF-α, IL-4 и IL-1β не оказались статистически значимы при сравнении групп (таблица 2).

Согласно бинарной логистической регрессии (поэтапное прямое добавление значимых цитокинов) установлено, что VEGF-A, IL-1Ra и IL-18 оказались наиболее диагностически значимы для ИЭ (таблица 3). Совокупность маркеров выявлена на третьем этапе последовательного включения цитокинов в модель регрессии, которая в 97,1% случаев верно относит обследуемого к соответствующей группе здоровых/пациентов с ИЭ. При этом максимальную информативность вносит VEGF-A (р=0,006), который был первым отобран согласно логистической регрессии, а также IL-18 (p=0,013) и IL-1Ra (p=0,02).

Включение четвёртого цитокина в модель не привело к увеличению достоверности модели, общий процент правильных определений остался прежним – 97,1%. Особенностью совокупности маркеров для уравнения логистической регрессии является то, что четвертым цитокином, по значимости оказался IL-1β, тогда как критерий U его вообще не обозначил, как значимый (p=0,352) (таблица 2). Нецелесообразно включать в модель логистической регрессии IL-1β с учётом того факта, что при добавлении последнего – значение p для большинства других переменных имеет тенденцию к увеличению и соответственно ухудшению предсказания модели: для VEGF-A на третьем этапе p=0,006, а на четвертом p=0,007; для IL-18 на третьем этапе p=0,013, на четвертом значение увеличивается до 0,015. И лишь IL-1Ra имеет незначительную тенденцию к снижению значения p – с 0,020 до 0,019. При этом сам IL-1β на 4 этапе включения имеет вероятность выше критического уровня значимости 0,05.

Таким образом, полученное уравнение бинарной логистической регрессии имеет следующий вид:

Y = 0,12*VEGF-A (pg/mL) + 0,007*IL-1Ra (pg/mL) +

+ 0,007*IL-18 (pg/mL) - 8,459

Где Y - стандартное уравнение регрессии, зная которое можно легко рассчитать вероятность наличия/отсутствия ИЭ подставив значение Y в формулу:

p = 1/(1+e-y)

где p – вероятность того, что у пациента имеет место инфекционный эндокардит;

e – основание натуральных логарифмов, приблизительно равное 2,718;

y – ранее установленное, уравнение регрессии.

Таким образом, посредством вышеуказанного уравнения логистической регрессии с включёнными в него тремя переменными (VEGF-A, IL-1Ra и IL-18), возможно рассчитать вероятность наличия заболевания, а именно – ИЭ, с достоверностью 97,1%.

Патофизиология инфекционного эндокардита, как и других подобных состояний непосредственно связана с воспалительной реакцией. Ответ эндотелиальных клеток в данном случае – это продукция различных цитокинов, интегринов и тканевых факторов, которые способны привлекать в очаг фибронектин, моноциты и тромбоциты. Сами бактерии, в месте крепления к эндотелию, дополнительно инициируют воспалительный ответ [7].

Анализируя результаты нашего исследования, следует отметить, что выявлены статистически достоверные отличия основной клинической группы с ИЭ от группы контроля среди сывороточных уровней следующих цитокинов: IL-8, IFN-γ,

Полученные результаты согласуются с исследованием других авторов. Так, Rawczynska-Englert I. et al. (2000) также выявили повышенные уровни IL-6 в сыворотке пациентов с ИЭ, причём уровни цитокина в первые дни оказались ещё более высокими (37,0 ± 44,3 пг/мл) в сравнении с нашим исследованием [8]. Данные подтверждаются и в более свежих источниках, где был изучен спектр цитокинов при ИЭ, в том числе IL-6 и выявлено его значимое повышение относительно контроля [4], [9], [10], [11].

Данные относительно IL-8 также согласуются с современными исследованиями концентрации цитокина и его высоких уровней среди пациентов с ИЭ [4], [9], [11], [12].

Одним из ключевых противовоспалительных цитокинов, увеличение которого оказалось значимым для пациентов с ИЭ, является IL-10, что находит своё подтверждение среди других исследований [4]. Примечательно, что авторы обнаруживают связь маркера и с длиной вегетации [13].

Медиана IL-18 в нашем исследовании характеризуется значимым превышением таковой в группе контроля в 2,23 раза. Diab M. et al. (2020) обнаружили повышение концентрации цитокина как в группе пациентов с ИЭ так и в контрольной группе, однако его уровни в клинической группе были значимо выше [14]. Исследование Venkatachalam et al. (2009) указывает на связь IL-18 с ухудшением состояния пациентов с заболеваниями сердца и сосудов, который является ключевым провоспалительным медиатором в патогенезе данных состояний [15].

Уровни IL-1Ra и VEGF-A (пг/мл) в сыворотке крови пациентов с ИЭ оказались крайне значимы и имели одни из самых высоких показателей в сравнении с группой контроля, так по IL-1Ra медианы отличались в 3,78 раза, а VEGF-A в 3,68. Тенденцию к влиянию на неблагоприятный исход ИЭ, связанный с перечисленными маркерами, обнаружили Ris T. et al. (2019) в своей работе, указав ассоциацию цитокинов с госпитальной смертностью [16].

Провоспалительный IFN-γ также указывает на свою значимость в патогенезе ИЭ, при уровне значимости p=0,02 в нашем исследовании, в сравнении с группой контроля. Коллеги, изучающие цитокин в свете эндокардита, подтверждают полученные нами данные в своих работах [11], [16].

Необходимо отметить факт, что в нашей работе выявили отсутствие связи по ряду цитокинов между пациентами с ИЭ и контрольной группой. Такими медиаторами явились: IL-17A, TNF-α, IL-4 и IL-1β. Что интересно, другие работы указывают на противоречивость данных относительно перечисленных цитокинов. Так, одни авторы указывают на отсутствие повышения уровней сывороточного TNF-α у пациентов с ИЭ [8], [10], [14]. Другие же утверждают, что концентрация цитокина была значимо выше в клинической группе по сравнению с контрольной [4], [9], [12]. Такая ситуация вполне объяснима тем фактом, что IL-10, как ключевой противовоспалительный цитокин способен снижать синтез некоторых провоспалительных цитокинов, в том числе TNF-α [17]. В нашем исследовании уровни IL-10 среди пациентов с ИЭ имеют более высокие значения, отличающиеся от контроля в 2,74 раза, поэтому не исключено его влияние на выработку TNF-α. В отношении IL-1β также данные научной литературы рознятся. Исследования Diab M. et al. не обнаружили повышения цитокина ни в группе пациентов с ИЭ, ни в контрольной группе [14], тогда как другие работы указывают на значимость IL-1β в патогенезе ИЭ [4], [10], [16]. При этом общеизвестный факт действия IL1-Ra, являющийся противовоспалительным цитокином, который подавляет действие (путём конкурентного связывания с рецепторами к IL-1) и контролирует синтез IL-1β [17] может быть объяснением крайне низких значений концентраций IL-1β у пациентов с ИЭ в нашем исследовании, при этом уровни IL1-Ra среди основной клинической группы достигают крайне высоких цифр – 1235,54 (566,91-4281,91) пг/мл. Также IL-10, который является мощным противовоспалительным цитокином, способен играть роль в подавлении выработки IL-1. Последний оказался значим для настоящего исследования, его медиана в группе пациентов в 2,74 раза выше группы контроля [18].

Противовоспалительный IL-4 в настоящем исследовании не оказался значим между клинической и контрольной группой (p=0,119), имеющий медианы концентрации 6,84 (4,13-13,89) пг/мл и 5,56 (2,53-12,66) пг/мл соответственно. Причиной тому могли служить повышенные концентрации IFN-γ, который способен ингибировать секрецию IL-4 [19].

Относительно слабо изученный провоспалительный цитокин IL-17A в свете ИЭ, не оказал влияние на патогенез заболевания в нашей работе. При этом Izadi S. et al. (2018) обнаружили повышение IL-10 и IL-17A среди пациентов с тромбозом в остром и подостром варианте ИЭ с дальнейшим возвратом их баланса  только в подостром варианте течения вследствие того, что IL-10 угнетает IL-17-опосредованные эффекты, что нужно для  профилактики прогрессирования повреждения тканей. Авторы также указывают на внутрисетевые влияния цитокинов, в частности, способность IL-10 существенно снижать содержание и эффекты IL-17 [

При этом, несмотря на роль многих маркеров в отношении патогенеза ИЭ, их значимость характерна лишь для единичных признаков (цитокинов) вне связи с другими медиаторами, но известно, что действие цитокинов сетевое, с множеством положительных и отрицательных влияний на секрецию друг друга. Именно поэтому посредством бинарной логистической регрессии выбран набор цитокинов, где учитывается их взаимное влияние на конечный исход, а именно, факт постановки диагноза – инфекционный эндокардит. Такими медиаторами, оказывающими наибольшую диагностическую значимость в свете ИЭ явились: VEGF-A, IL-1Ra и IL-18. Модель регрессии с таким набором цитокинов в 97,1% случаев правильно относит обследуемого к соответствующей группе здоровых/пациентов с ИЭ. При этом наибольший вклад вносит VEGF-A (р=0,006), что не удивительно, ведь усиленная продукция фактора роста необходима для усиления роста сосудов и дополнительной репарации повреждённых тканей [21].

Таким образом, с позиции актуальности исследования и внедрения в практическую медицину дополнительных цитокиновых маркеров в лабораторной диагностике инфекционного эндокардита представляет интерес анализ, углубление и дополнение научных данных о роли цитокинов в патогенезе ИЭ. Настоящее исследование позволяет убедиться в значимости IL-8, IFN-γ, IL-1Ra, IL-18, VEGF-А, IL-6 и IL-10 в свете эндокардита, при этом наиболее диагностически значимыми оказались  VEGF-A, IL-1Ra и IL-18, что обосновывает рассмотрение возможности оптимизации диагностики заболевания за счёт включения перечисленных иммунологических маркеров. Последующие исследования различных цитокинов позволят собрать и систематизировать дополненные знания о диагностических подходах и прогнозе заболевания, что очень важно для ранней диагностики ИЭ и ведения пациентов.