DETERMINATION OF THE POLYSACCHARIDE SUM OF THE ROOTS OF TARAXACUM OFFICINALE WIGG. GROWING IN THE NORTH CAUCASUS

При использовании инулина, сложного полисахарида, относящегося к фруктозанам, снижается уровень глюкозы в крови у больных сахарным диабетом, уровень холестерина, триглицеридов и фосфолипидов крови, улучшается обмен липидов, выводятся из организма различные токсины [1], [2]. В связи с постоянно возрастающим уровнем заболеваемости сахарным диабетом, в настоящее время увеличивается спрос на природные источники инулина [3]. Известно, что корни одуванчика лекарственного содержат большое количество водорастворимых углеводов, представленных моно- и олигосахаридами, инулином, полифруктанами, пектиновыми полисахаридами, крахмалом и целлюлозой [2]. Кроме полисахаридов из корней одуванчика лекарственного выделены свободные моносахариды, доминирующим моносахаридом при этом является фруктоза [1], [2]. На примере определения  суммарного выхода водорастворимых полисахаридов корней одуванчика, произрастающего в Иркутской области, показано, что в пересчете на абсолютно сухую массу он может достигать 65,2%. При помощи ЯМР спектроскопии и ГХ-МС после кислотного гидролиза определено, что в состав исследуемых полисахаридов одуванчика лекарственного входят в основном такие моносахариды как арабиноза, ксилоза, галактоза и глюкоза. Содержание глюкозы при этом находится в пределах 70 % от суммы моносахаридов что можно объяснить присутствием в составе фракции в качестве основных компонентов глюкана и/или фруктанов, гидролиз которых сопровождается изомеризацией фруктозы в глюкозу [4]. Н.П. Тигунцевой в корнях одуванчика лекарственного, собранного до цветения растения в Иркутской области, найдено 44% инулина [5]. Содержание инулина в корнях одуванчика может колебаться в зависимости от фазы вегетации и территории произрастания, а именно от 2% до 16% весной и до 25 - 40% осенью [1], [3], [6], [8]. Найдено, что торговые образцы корней одуванчика содержат около 35% водорастворимых полисахаридов и до 10% спирторастворимых углеводов [9]. Литвиненко В.И. и Бубенчиковой В.Н. из корней одуванчика препаративно выделено до 40% инулина [10].

Для определения полисахаридов, в том числе и инулина, почти во всех исследованиях применялся метод спектрофотометрии, в основе которого лежит цветная реакция взаимодействия фруктозы (образуется при гидролизе инулина) с резорцином в кислой среде [1], [5], [9], [11]. Однако, фруктозосодержащие соединения обнаружены в составе свободных углеводов корней одуванчика лекарственного, а также ряда олигомеров, что свидетельствует о необходимости предварительной обработки сырья, способствующей удалению низкомолекулярных углеводов. С этой целью сырье можно обезжиривать в аппарате Сокслета и спиртом 95% извлекать свободные сахара и спирторастворимые БАС, а затем инулин экстрагировать водой при нагревании [1]. Описан способ извлечение сырья при нагревании спиртом 95% свободных сахаров и спирторастворимых БАС, с последующей экстракцией инулина водой [11]. Л.М. Танхаевой и  Д.Н. Оленниковым [12] показано, что при взаимодействии инулина с резорцином наибольшая оптическая плотность растворов развивается через 7–8 мин. нагревания. Однако через 1 час окраска снижается почти на 35%. Установлено, что введение тиомочевины вызывает повышение оптической плотности с последующим периодом стабильности окраски до 120 мин. Это позволило авторам разработать методику определения суммарного содержания полифруктанов в корнях одуванчика лекарственного. Она оказалась правильной и воспроизводимой [11]. Вариант методики спекторофотометрического определения инулина, описанный в ФС «Девясила высокого корневища и корни» ГФ РФ XIV изд. [13], основан на непосредственном извлечении суммы полисахаридов водой при нагревании с последующим осаждением мешающих БАС раствором свинца(II) ацетата 10%. В литературе описаны также методики гравиметрического определения суммы полисахаридов после осаждения их из водного извлечения спиртом этиловым 96% [8]. Однако известно, что вследствие неудовлетворительных преципитационных характеристик фруктанов не всегда можно добиться количественного спиртового осаждения полисахаридов [8]. В связи с этим метод был модифицирован заменой стадии нагревания ультразвуковой обработкой водного извлечения корней одуванчика и последующим осаждением суммы полисахаридов спиртом 95% и выдерживанием в морозильной камере, что позволило не только стабилизировать процесс экстракции, но и сократить его время до 3,5 часов [8]. Так как в ГФ РФ XIV для корней одуванчика представлена только методика качественного обнаружения инулина [13], представляет интерес провести определение суммы водорастворимых полисахаридов на примере корней одуванчика, произрастающего на Северном Кавказе в различные стадии вегетации.

Объектами настоящего исследования служили отмытые от следов грунта, воздушно-сухие корни одуванчика лекарственного, собранные у подножья горы Машук (Ставропольский край, г. Пятигорск) в апреле и сентябре 2019 года. Сырье выкапывали лопатой, отряхивали от грунта, срезали надземную часть. Высушенное сырье измельчали при помощи дисковой дробилки.

Количественное определение суммы водорастворимых полифруктанов корней одуванчика лекарственного проводилось по трем различным методикам:

1) спекторофотометрическая методика, описанная в ФС «Девясила высокого корневища и корни» ГФ РФ XIV изд. [13] Содержание суммы фруктозанов и фруктозы в пересчете на инулин в абсолютно сухом сырье в процентах вычисляли, используя  удельный показатель поглощения продуктов реакции инулина с резорцином в кислой среде при длине волны 483 нм, равный 498;

2) спекторофотометрическая методика определения суммарного содержания полифруктанов в корнях одуванчика лекарственного [11], которое  вычисляли в %, используя оптическую плотность раствора стандартного образца фруктозы;

3) гравиметрическая методика определения содержания водорастворимых полисахаридов (ВРПС) в корнях одуванчика лекарственного [8].

Обработка результатов эксперимента проведена в соответствии с требованиями ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» в программе Microsoft Excel 2016 [13].

Методика, описанная в ФС «Девясила высокого корневища и корни» ГФ РФ XIV изд. [13] заключается в трехкратной экстракции сырья водой очищенной при нагревании с последующим осаждением мешающих БАС. С аликвотой фильтрата полученного раствора проводят реакцию со спиртовым раствором резорцина и хлористоводородной кислотой 30%. Результаты определения суммы сахаридов в пересчете на инулин показаны в таблице 1. Методика многостадийна, требует трехкратного процесса экстракции водой в течении длительного периода времени и многократного процесса фильтрации. Так как окраска раствора после реакции с резорцином нестабильна, необходимо соблюдение, как условий проведения реакции, так и времени ее исполнения. Содержание суммы фруктозанов и фруктозы в пересчете на инулин в корнях, собранных в сентябре месяце достигает 38 %. Относительная погрешность определения находится в пределах 3 % (см. таблицу 1).

Спекторофотометрическая методика, предложенная для определения суммарного содержания полифруктанов в корнях одуванчика лекарственного [11], отличается от методики, описанной в ФС «Девясила высокого корневища и корни» ГФ РФ XIV изд. [13], тем, что на первой стадии проводят трижды экстракцию спирторастворимых соединений с помощью спирта этилового 95% на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Затем обработанное сырье экстрагируют трижды водой очищенной. К аликвоте объединенного извлечения добавляют растворы тиомочевины и резорцина, спирт этиловый 95% и кислоту хлористоводородную концентрированную, нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. Аналогичное определение проводят с раствором стандартного образца фруктозы. Суммарное содержание полифруктанов в % приведено в таблице 2. Приведенная методика еще более многостадийна и длительна, так как вводится дополнительная стадия извлечения спирторастворимых БАС, для проведения анализа требуется не менее 7 часов рабочего времени. Полученные результаты (см. таблицу 2) свидетельствуют о том, что относительная погрешность определения этой методики оказалась почти в 1,5 раза ниже вышеописанной. Очевидно, это связано с усовершенствованием условий проведения цветной реакции [12].

Гравиметрическая методика определения содержания водорастворимых полисахаридов в корнях одуванчика лекарственного [8] заключается в получении водного извлечения в ультразвуковой ванне при температуре 80°С в течении 40 мин. Затем с помощью спирта этилового 95 % осаждают нерастворимые в спирте полисахариды (инулин) и для полноты осаждения извлечение охлаждают в морозильной камере при температуре -18°С. Суммарное содержание полифруктанов в % показано в таблице 3. Гравиметрическая методика на наш взгляд более проста в исполнении. Относительная погрешность определения находится в пределах 1,5% (см. таблицу 3). Время, затраченное на анализ, не превышает 4 часов.

Данные предварительного исследования, проведенные на образцах сырья, собранного с одного участка, показали, что содержание водорастворимых полисахаридов в корнях одуванчика лекарственного, произрастающего на Северном Кавказе, в сентябре месяце достигает 30 - 38%, что значительно превышает это содержание в корнях, собранных в весенний период вегетации растения (9– 19%). Использование методики, описанной в ФС «Девясила высокого корневища и корни» ГФ РФ XIV издания, позволяет определять только сумму фруктозанов и фруктозы в пересчете на инулин. Спектрофотометрический метод, где используется стадия удаления спирторастворимых углеводов, позволяет получать более объективные результаты содержания водорастворимых полисахаридов и частности инулина в сырье одуванчика лекарственного, но данный метод наиболее трудоемкий. Следует отметить, что гравиметрическая методика по сравнению со спектрофотометрической методикой, менее многостадийна и трудоемка.