Application of the QuPPe method in the analysis of plant products using pesticides of different chemical nature as an example

Подготовка проб при анализе остаточных количеств пестицидов в растительной продукции может быть реализована различными подходами: жидкостная экстракция, экстракция с гидролизом, дериватизация, твердофазная экстракция и другие. Весьма распространенной на сегодняшний день является система пробоподготовки QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe - Быстро Просто Дёшево, Эффективно, Надежно и Безопасно). Метод отличается простотой и быстротой выполнения [1].  

Ключевой частью метода Quechers является разделение водной и органической фаз экстракта. Естественно, с водной фазой теряются и водорастворимые высокополярные пестициды. Для их определения разработана концепция QuPPe Method (Quick Polar Pesticides Method–Быстрый метод анализа полярных пестицидов) [2].

Этот метод позволяет одновременно анализировать ряд высокополярных пестицидов. Метод включает экстракцию подкисленным метанолом и измерение ВЭЖХ-МС/МС с использованием изотопных меченых внутренних стандартов для точной количественной оценки.  

Метод является динамичным и периодически обновляется по мере внедрения большего количества пестицидов или возможностей разделения. Существует вариант для продуктов растительного происхождения и для продуктов животного происхождения (в настоящее время опубликован метод анализа молока и яиц).

Метод QuPPe не подразумевает значительную очистку от ко-экстрактивных примесей. Поэтому основное значение приобретают свойства применяемых при выполнении анализа хроматографических колонок.

Современный уровень развития сорбентов для ВЭЖХ колонок позволяет реализовывать смешанную хроматографию (multi-mode chromatography, MMC). Методология ММС, первоначально решающая задачи анализа больших молекул (протеинов) [3], предполагает использование достаточно широкого круга лигандов, ориентированных на специфическое разделение конкретных групп аналитов и их изоляцию от ко-экстрактивных веществ. Одновременно с этим был разработан механизм моделирования поведения пар лиганд – целевое соединение, что дало значительный толчок в развитии специализированных колонок (аналитических и препаративных). Сейчас это быстро развивающаяся область благодаря новому поколению смешанных стационарных фаз. MMC имеет значительно расширенные возможности для разделения соединений, которые не удерживаются или  плохо разделяются типичными методами жидкостной хроматографии, особенно для полярных и заряженных молекул. В отличие от обращенно-фазовой, ионообменной и нормально-фазовой хроматографии, в которых гидрофобное, гидрофильное и ионное взаимодействия соответственно являются доминирующими режимами, смешанный режим использует комбинацию двух или более типов взаимодействия, что и реализуется на одной колонке ММС.

Рынок пестицидов постоянно предлагает новые комплексные препараты, сочетающие соединения различной направленности. Так, один из современных продуктов содержит в качестве действующих веществ фосэтил алюминия и изотианил. Препарат рекомендуется для различных плодовых и овощных культур: картофель, яблоки, виноград, огурцы. Кроме того, вопрос о необходимости разработки методики контроля остаточных количеств этих веществ в перечисленных видах растительной продукции является актуальным для продукции импортируемой. Оптимальным с точки зрения экономии ресурсов лаборатории, сокращения сроков испытаний продукции, предназначенной для потребителя в свежем виде является подход совместного определения действующих веществ.

Смесевой препарат на основе фосэтил алюминия и изотианила включен в план биологических испытаний с целью его регистрации на данных культурах.

На практике не принято определять пестициды различной химической природы одним методом. В данной работе была поставлена задача разработки нового подхода к совместному определению фосэтил алюминия и изотианила в картофеле, яблоках, винограде, огурцах, относящихся к матрицам разных типов.

Фосэтил алюминия (алюминиум трис-О-этилфосфонат) представляет собой фунгицид широкого спектра действия, быстро всасывается листьями и корнями различных культур [4].

Молекула фосэтил алюминия обладает низкой молекулярной массой, ионной структурой, соединение растворимо в воде, характеризуется отсутствием ультрафиолетового поглощения или флуоресценции. Поэтому традиционно в окружающей среде и продуктах питания его определяют с помощью ион-парной обращенной ВЭЖХ [5], [6] или с использованием хроматографии на основе гидрофильного межмолекулярного взаимодействия (HILIC) колонок [7], [8], [11], [12].

Изотианил (3,4-дихлор-2'-циано-1,2-тиазол-5-карбоксанилид) – сравнительно новый пестицид, активирующий растения, т.е. само вещество непосредственно не проявляет антимикробной активности против патогенного микроба, но вызывает системную приобретенную резистентность в растении-хозяине. По строению молекулы он гораздо менее полярен, чем фосэтил алюминия. Хорошо растворим в органических растворителях.

Количество литературных источников по определению изотианила в различных средах весьма ограничено. Например, в [13] изотианил экстрагировали из коричневого риса и почвы сверхкритической жидкостной экстракцией и определяли с помощью газовой хроматографии с масс-детектором.

Использованы аналитический стандарт фосэтила алюминия с содержанием основного вещества 98,9 %, (CAS No. 39148-24-8) и аналитический стандарт изотианила с содержанием основного вещества 99,6 % (CAS No. 224049-04-1). Применяемые реактивы: ацетонитрил, метанол класса для ВЭЖХ-МС, вода деионизованная, муравьиная кислота чистотой 99,7%, формиат аммония чистотой более 99%.

Анализ осуществлен с применением хроматографа жидкостного Exion AD с масс-селективным детектором Sciex QTrap 6500+ (свидетельство о метрологической поверке № С-ТТ/09-03-2022/138212151 действительно до 08.03.2023 года). Хроматографическая колонка «Obelisc R» (150х2,1 мм, 5мкм, 100А). Температура термостата колонок 40°С. Режим элюирования градиентный бинарный. Элюент А: 50 мМ раствор формиата аммония в воде, рН=3, элюент В: ацетонитрил. Объем вводимой пробы: 5 мм3. Тип ионизации: электроспрей. Полярность: отрицательная. Тип сканирования: мониторинг множественных реакций (MRM). Были выбраны следующие масс-переходы: фосэтил алюминия 108,9/81 (количественный), 108,9/63 и 108,9/79 подтверждающие; изотианил 296/152 (количественный), 298/154 подтверждающий.

Все исследуемые объекты для приготовления образцов с внесением (картофель, виноград, яблоки, огурцы) были приобретены в розничной торговой сети. Подготовку образцов проводили согласно [14].

Фрукты и овощи измельчали криогенным способом (с использованием сухого льда). Это необходимо для уменьшения деградации аналитов и уменьшения размера частиц, что приводит к улучшению однородности и доступности для экстракции остаточных количеств веществ.

Подготовка проб осуществлялась способом, описанным в [2]: взвешивали репрезентативную навеску гомогената пробы массой 10 г. Добавляли 10 мл метанола, содержащего 1% муравьиной кислоты. Встряхивали на вихревом шейкере, центрифугировали и фильтровали надосадочную жидкость через шприцевой фильтр с размерами пор 0,45 мкм в виалу для дальнейшего анализа. Перед приготовлением образцов с внесением все матрицы были проанализированы для доказательства отсутствия искомых аналитов.

Для совместного определения изотианила и фосэтил алюминия был выбран метод QuPPe, поэтому тип хроматографической колонки имел  решающее значение. Задачу усложняло присутствие значительных количеств ко-экстрактивных веществ – крахмала, органических кислот, микро- и макроэлементов, преимущественно водорастворимых. Поэтому в дополнение к экстракции применялось выдерживание проб при температуре не выше -18°С не менее трех часов, что обеспечивало осаждение значительной части растворенных веществ и служило дополнительной защитой хроматографической колонки от загрязнения.

Для хроматографирования была выбрана колонка Obelisc R, позволяющая работать со значительными количествами воды в подвижной фазе, имеющая катионные группы, расположенные близко к поверхности диоксида кремния и отделенные от анионных групп гидрофобной цепью, позволяющей реализовывать нескольких режимов разделения – обращено-фазовый, HILIC и ионообменный.

Для оптимального выбора подвижной фазы были исследованы различные ее составы. Показано, что концентрация формиата аммония играет значительную роль при формировании пика фосэтил алюминия и не влияет на пик изотианила. Так, при концентрации формиата аммония в подвижной фазе 20 ммоль пик фосэтил алюминия имел две вершины, при увеличении концентрации соли до 50 ммоль пик стал четким и собранным. Предположительно, влияние концентрации соли связано с увеличением конкуренции за растворимость в водной части подвижной фазы, что также можно считать подтверждением реализации механизма взаимодействия HILIC для фосэтил алюминия. Отсутствие такого влияние на пик изотианила говорит о взаимодействии по другому механизму, предположительно обращено-фазовому.

Был оценен матричный эффект для фосэтил алюминия и изотианила для каждого вида исследуемой продукции (картофель, виноград, яблоки, огурцы). Калибровка на матрице выполняется в случае подавления или усиления сигнала более чем на 20% [15]. Так, для различных матриц этот эффект составил: для картофеля 65%, для яблок и винограда 60%, для огурцов 5%. Поэтому для анализируемых продуктов была выполнена калибровка на матрице, кроме огурцов, результаты определения в пробах которых рассчитывались по абсолютной калибровке (на растворителе).

В навески измельченных проб вносили различные количества смеси пестицидов, соответствующие концентрациям от 0,01 до 0,1 мг/кг. Нижний предел количественного определения фосэтила алюминия и изотианила в пробах - 0,01 мг/кг.

Погрешность измерения концентраций и ее составляющие определены на основе процедур контроля погрешности в соответствии с нормативными документами [16], [17], [18].

Погрешность измерения оценена с применением расчетно-экспериментального метода в виде суммы неисключенной систематической и случайной составляющих по РМГ61-2010, приложение В [17].

Случайная погрешность определялась на основании 5 параллельных измерений при внесении определенного количества веществ в образец в 4 точках по диапазону линейности определяемых концентраций (по 5 повторностей для каждой концентрации, Р= 0,95).

Средняя степень извлечения пестицидов и среднеквадратичное отклонение приведены в таблице 1.

Полученные данные соответствуют необходимым требованиям по степени извлечения и стандартному отклонению, предъявляемым к валидации методики [15].

Показатель точности находится в границах ±50% (Р=0,95).

Таким образом, показана возможность расширения области применения метода QuPPe, в том числе для анализа пестицидов традиционно определяющихся с помощью методологии QuEChERS, для совместного извлечения и определения пестицидов различной химической природы благодаря одновременной реализации нескольких механизмов взаимодействия с неподвижной фазой хроматографической колонки.