DEVELOPMENT OF ENZYME DRUGS BASED ON COLLAGENASES: A COMPARATIVE REVIEW OF MODERN TECHNOLOGIES AND METHODS
DEVELOPMENT OF ENZYME DRUGS BASED ON COLLAGENASES: A COMPARATIVE REVIEW OF MODERN TECHNOLOGIES AND METHODS
Abstract
The article is devoted to the analysis of modern approaches to the development of enzyme drugs based on collagenases — key agents for the treatment of wounds, burns and scar lesions. The relevance of the study is due to the growing number of complicated wounds (diabetic, trophic) and the necessity of import substitution in the conditions of sanctions pressure on the Russian pharmaceutical industry. The paper systematises data on natural and recombinant sources of collagenases, including bacterial (Clostridium histolyticum) and fungal (Aspergillus) producers, marine animal raw materials (crab hepatopancreas). Advantages and disadvantages of each type of starting material for collagenase production were noted. A comparative analysis of their specificity, activity and safety was carried out.
1. Введение
Коллагеназы — это ферменты семейства металлозависимых протеиназ матрикса, способные гидролизовать нативный коллаген. Эти ферменты играют решающую роль при развитии таких физиологических процессов, как морфогенез, резорбция и ремоделирование тканей, миграция, адгезия, дифференцировка и пролиферация клеток, а также при патологических состояниях (ревматоидный артрит, гломерулонефрит, пародонтиты, изъязвление роговой оболочки глаз и др.)
.Актуальность исследований в этой области подчеркивается растущей распространенностью патологий, требующих применения коллагеназ: хронические раны (диабетические, трофические), ожоги, гипертрофические рубцы, некротические поражения и заболевания опорно-двигательного аппарата. По данным ВОЗ, только в 2022 году в мире зарегистрировано более 10 млн случаев осложненных ран, требующих ферментативной терапии, что ставит вопрос о необходимости совершенствования существующих препаратов и поиска инновационных решений в этой области.
2. Классификация и источники коллагеназ
Коллагеназы подразделяются на несколько групп в зависимости от структуры, механизма действия и происхождения:
- Микробные и грибные коллагеназы. Продуцируются бактериями рода C. histolyticum, грибами Aspergillus, Penicillium и актиномицетами. Они характеризуются высокой активностью, но могут вызвать иммунный ответ из-за примесей бактериальных эндотоксинов
.- Животные коллагеназы. Выделяются из тканей крабов (гепатопанкреас), рыб (поджелудочная железа), пиявок (Hirudo medicinalis). Они более специфичны к коллагену I типа, но сложны в очистке.
- Рекомбинантные коллагеназы. Получают методами генной инженерии (например, экспрессия гена coIH в E.coli) Имеют преимущество в высокой чистоте.
2.1. Микробные коллагеназы
Среди микробных коллагеназ, продуцируемых бактериями рода Clostridium, известны коллагеназы C. histolyticum, C. perfringens, C. tetani, также применяют бактерии Achromobacter iophagus, Pseudomonas aeruginosa, Streptomyces lavandulae. Среди микроорганизмов наиболее изученными продуцентами коллагеназы являются анаэробные бактерии рода Clostridium, особенно C. histolyticum
.Коллагеназы, полученные из C. histolyticum, наиболее часто используются для получения лекарственных средств. Микробные протеазы представляют собой одноцепочечные белки с массами от 68 кДа до 130 кДа
. На данный момент современные биотехнологические стратегии активно смещаются в сторону растительных альтернатив питательных сред для C. histolyticum. Этот тренд обусловлен не только этическими требованиями, но и необходимостью исключить риски контаминации прионами при использовании животных компонентов в производстве лекарственных препаратов .C. histolyticum является «золотым» стандартом для производства коллагеназ (препарат «Коллализин») — продуцирует коллагеназу типа I (ColH) и типа II (ColG), расщепляющих разные участки коллагена. Фермент селективно расщепляет перекрёстные связи коллагена в бляшках, не повреждая эластин и гладкомышечные волокна
.Преимущества: микробные коллагеназы отличаются от коллагеназ животных тем, что они проявляют более широкую субстратную специфичность, расщепляют нативный и денатурированный коллаген, и имеет более высокую коллагеназную активность. Бактериальная коллагеназа уникальна тем, что она может разрушать нативные коллагены и водорастворимые денатурированные коллагены. Она может воздействовать практически на все типы коллагена и способна образовывать множественные углубления в областях тройной спирали
. В качестве дополнительных преимуществ следует отметить неограниченность источников получения, возможность экзогенной регуляции, отсутствие прионов, относительная простота процессов выделения и очистки, возможность генно-инженерных манипуляций . В свою очередь, микробные ферменты — наиболее эффективные деструкторы коллагена .Недостатки: токсичность бактериальных лизатов, необходимость многоступенчатой очистки, патогенность и анаэробность продуцента, повышенные требования безопасности на всех стадиях производства и реализации.
2.2. Грибные коллагеназы
Для синтеза коллагеназы используют мицелиальные грибы рода Aspergillus, которые имеют выход фермента до 15–20 мг/л, термостабильность 45°C
.Преимущества: мицелиальные грибы являют источниками многих гидролаз и обладают способностью изменять качественный и количественный состав секретируемых ферментов в ответ на введение в состав питательных сред тех или иных субстратов-индукторов
, высокая активность по отношению к коллагену I типа.Недостатки: длительный период культивирования, включение коллагена в питательную среду для частичного замещения сахарозы и обеспечения специфичных условий, не все микроорганизмы могут расти в условиях пониженной влажности; не полностью обеспечивается доступность компонентов среды; биосинтетические процессы протекают медленнее из-за влияния диффузионных ограничений; трудно контролировать параметры процесса, высокая стоимость, которая определяет и стоимость получаемого продукта; большой выброс сточных вод
, .2.3. Животные коллагеназы
Гепатопакнреас камчатского краба (Paralithodes camtschatica) используется в препарате «Дигестол» с известной активностью 120–150Ед/мг. Выделяют так же коллагеназы из внутренностей рыбы
, .Преимущества: Препараты на основе крабовой коллагеназы характеризуются меньшей частотой побочных реакций, включая аллергические реакции и локальное раздражение, что подтверждает их преимущество для длительной терапии патологических рубцов
, .Недостатками такого способа получения коллагеназы является неспособность полученных ферментов расщеплять нативный коллаген, что сужает сферу их применения. Кроме того, использование такого сырья усложняет получение высокоочищенных коллагеназ
.Некоторые недостатки использования животного сырья для синтеза коллагеназы: неспособность полученных ферментов расщеплять нативный коллаген, что сужает сферу применения коллагеназы; сложности с получением высокоочищенной коллагеназы, образование большого количества отходов при получении коллагеназы из гепатопанкреаса, которые необходимо утилизировать; использование высоких концентраций поверхностно-активных веществ и солей в процессе выделения коллагеназы, способных разрушить экологическое равновесие окружающей среды; отсутствие стадии удаления липидов, содержащихся в гепатопанкреасе крабов, высокое содержание которых сказывается на стабильности конечного продукта из-за окисления липидов и эффективности проведения ультрафильтрации, так как рабочие мембраны быстро выходят из строя и длительность процесса получения коллагеназы, что снижает выход продукта и уровень его активности.
2.4. Рекомбинантные коллагеназы
Для синтеза рекомбинантной коллагеназы используют системы экспрессии E. coli для генных конструкций коллагеназы Т из C. tetani, коллагеназы G и H из C.histolyticum. Разработанные способы получения показали свою эффективность.
Преимущества применения E. coli для синтеза коллагеназы: возможность получения большого количества белка (не менее 10 мг высокочистого моноизоформного белка на литр культуры); гибкая платформа для очистки; возможность скрининга рекомбинантных коллагеназ; быстрота, экономичность и простота установки производственной платформы.
Недостатки: потеря плазмиды и антибиотических свойств; отсутствие посттрансляционных модификаций, в том числе способности образовывать дисульфидные связи; неправильная укладка белка; редкое использование некоторых кодонов; загрязнение эндотоксином; для получения полностью функциональных полипептидов при использовании E. coli требуется сложная и обширная обработка
. В качестве продуцентов коллагеназы используются различные микроорганизмы (Табл.)Таблица 1 - Источник и основные свойства коллагеназ
Источник | Активность (ед/мг) | Специфичность | Риск аллергенности |
Clostridium histolyticum | 200-250 | коллаген I-IV типов | высокий |
Гепатопанкреас краба | 120-150 | коллаген I типа | умеренный |
Рекомбинантные бактерии E. coli | 180-200 | коллаген I-III типа | низкий |
Мицелиальные грибы рода Aspergillus | 80-100 | коллаген I типа | низкий |
3. Заключение
У ферментных препаратов на основе коллагеназы имеется огромный потенциал использования. Уже сейчас фермент применяется в различных областях медицины, включая хирургию, дерматологию и регенеративную медицину. На основании данного анализа, было показано, что бактериальные коллагеназы из Clostridium histolyticum наиболее изучены и имеют преимущества перед коллагеназами животных и грибов. Такие ферменты имеют достаточно широкую субстратную специфичность, расщепляют нативный и денатурированный коллаген, проявляют более высокую коллагеназную активность, что для разработки ферментного препарата является важнейшим параметром.