DEVELOPMENT A BIOCHIP FOR IMMUNOCHEMICAL AND MOLECULAR BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE MICROORGANISM OF THE GENUS SALMONELLA

Титова М.А. ¹, Афонюшкин В.Н. ², Шкиль Н.А.³, Коптев В.Ю.⁴

^1,4 Кандидат ветеринарных наук; ²кандидат биологических наук; ³доктор ветеринарных наук, профессор, Государственное научное учреждение

Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии

РАЗРАБОТКА БИОЧИПА ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОЙ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА SALMONELLA 

Аннотация

Статья посвящена исследованию нового метода иммунохимического типирования изолятов сальмонелл с помощью биочипа и является одним из этапов работы по выявлению эпидемиологически значимых штаммов сальмонелл, что необходимо с позиции дифференциальной диагностики и выявления как не патогенных, так и потенциально опасных штаммов.

Ключевые слова: Salmonella enterica, серотип, биочип.

Titova M.A.¹, Afonyushkin V.N.², Shkil N.A.³, Koptev V. Yu.⁴

^1,4PhD in Veterinary science; ²PhD in Biological science; ³ Doctor of Veterinary Sciences, Professor, The Research Institute of experimental veterinary medicine of Siberia and the Far East

DEVELOPMENT A BIOCHIP FOR IMMUNOCHEMICAL AND MOLECULAR BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF THE MICROORGANISM OF THE GENUS SALMONELLA

Abstract

The article is devoted to the study of a new method for immunochemical typing of Salmonella`s isolates using the biochip and is one of the stages of the identification of epidemiologically significant strains of Salmonella that is necessary from the standpoint of differential diagnosis and identification as non pathogenic and potentially dangerous strains.

Keywords: Salmonella enterica, serotype, the biochip.

Помимо санитарной безопасности пищевой продукции, сальмонеллезы сельскохозяйственных животных наносят экономический ущерб сельхоз предприятиям за счет гибели животных, снижения продуктивности, дополнительных издержек на обеззараживание продукции, ограничений на экспорт продукции из неблагополучных по сальмонеллезу хозяйств. В связи со значительным разнообразием серотипов сальмонелл (около 2500), возможности по детальному молекулярно-биологическому их типированию ограничены. Необходимость идентификации серотипов сальмонелл обусловлена потребностью в отслеживании циркуляции сальмонелл, своевременного выявления инфицированности тем или иным серотипом с целью раннего прогнозирования вспышек сальмонеллеза [1].

Существуют классические методы иммунохимического типирования сальмонелл с использованием гипериммунных и истощенных сывороток против О, Н и Vi антигенов сальмонелл (агглютинация, преципитация).

В последние годы все более пристальное внимание привлекается к разработке миниатюризированных аналитических методов диагностики, характеризующихся высокой доступностью и вместе с тем обладающих достаточными уровнями чувствительности и специфичности. Наиболее яркими представителями аналитических систем, сочетающих в себе перечисленные качества, являются биочипы [2,3]. Их используют преимущественно в биологии, биотехнологии и медицине: для диагностики атеросклероза и ишемической болезни сердца [4]; онкологии [3]. В России отсутствуют данные о разработке и применении в ветеринарной практике биочипов, в том числе для серологического анализа различных серотипов сальмонелл.

Цель работы – определить серотипы микроорганизмов Salmonella enterica с помощью биочипа.

Для определения серотипа микроорганизмов Salmonella enterica использовали 4 культуры Salmonella enterica следующих серотипов: typhimurium, enteritidis, dublin, paratyphi A, а также сыворотки к О и Н  антигенам S. enterica (BioRad).

В качестве биочипа использовали предметное стекло,  покрытое 3% раствором альбумина с добавлением 0,1% глицерина и 0,01% амидочерного 10B. На подготовленные стекла наносили антитела к соматическим (О-антигенам) и жгутиковым (Н-антигенам) Salmonella enterica  по 0,1 мкл на точку. Биочипы подсушивалии в течение 3-х часов и инкубировали в 0,2 % растворе глютарового альдегида при +5^оС в течение 20 часов. Далее их споласкивали дистиллированной водой, погружали в 1% раствор бычьего сывороточного альбумина с 0,02% твин-20 в фосфатно-солевом буфере (50мМ, рН 7,2-7,4), инкубировали 2 часа, споласкивали дистиллированной водой и высушивали.

Проведение анализа осуществляли следующим образом. Суспензию инактивированных Salmonella sp. в концентрации 1х10⁵ микробных кл./мл, кипячением в течение 30 минут, ресуспендировали в буферном растворе,  содержащем  50мМ ТрисHCl, 0,02% твин-20, 50мМ NaCl и пропидиум иодид в концентрации 2 мкг/мл. Суспензию наносили на поверхность биочипа в количестве 100 мкл, накрывали полиэтиленовой пленкой и инкубировали 2 часа при комнатной температуре. После инкубации удаляли несвязавшиеся клетки путем споласкивания в буферном растворе, содержащем  50мМ Трис HCl, 0,02% твин-20, 50мМ NaCl, споласкивали в дистиллированной воде и проводили детекцию связавшихся бактерий с использованием трансиллюминатора. При образовании комплекса «антиген-антитело» на биочипе видны светящиеся пятна, локализованные в местах, где нанесены антитела, специфичные данному антигену (результаты представлены в таблице).

 

Таблица 1 – Оценка чувствительности биочипа

Серотип микроорганизмов рода Salmonella	Обнаружен комплекс взаимодействия с антителами к антигенам
typhimurium,	HMA, O 4,5
enteritidis	ОМА, HMB, О9,
dublin	ОМА, О9, Hg
paratyphi A	ОМА (группа А и В), H2, О 4,5

Из представленных в таблице данных видно, что обнаруженные антигены соответствуют антигенной структуре серотипов Salmonella enterica,  серотипов typhimurium, enteritidis, dublin, paratyphi A.

Таким образом, предложен простой и чувствительный метод, позволяющий определять антигенную структуру бактерий и проводить детекцию результатов реакций одномоментно без микроскопирования с использованием дешевых систем визуализации.

 

Литература

1. Афонюшкин В.Н. Сравнительная оценка микробиологических и молекулярных методов выявления сальмонелл в кишечном содержимом у сельскохозяйственной птицы / В.Н. Афонюшкин [и др.] // Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана. Сборник научных докладов XIII Международной научно-практической конференции (Улаанбаатар, 6-7 июня 2010 г.) – С. 56-60.
2. Биочипы для медецинской диагностики / В.Р. Чечеткин, Д.В.Прокопенко, А.А. Макаров, А.С. Заседателев // Российские нанотехнологии. – 2006. – Т. 1. – № 1-2. – С. 13-28.
3. Шишкин А.В. Разработка новых методов исследования лимфоцитов и эритроцитов с помощью иммунологических биочипов: автореф. дис. … канд. мед. наук / А.В. Шишкин. – Москва, 2008. – 22 с.
4. Koester C.J. Environmental аnalysis / C.J. Koester, S.L. Simonich, B.K. Esser // Analytical Chemistry. – 2003. – Vol. 75. – P. 2813-2819.