FLAVONOIDS OF LEMON VERBENA LEAVES

Листья вербены лимонной издревле широко применяются в народной медицине для лечения различных заболеваний [1], [4], [5], [6]. Вербена лимонная богата фенольными соединениями такими, как фенилпропаноиды, фенолокислоты, флавоноиды, дубильные вещества [7]. В настоящее время проводится интенсивное изучение биологических свойств полифенольных соединений, в частности, флавоноидов. Фармакологическое действие флавоноидов обусловлено их антиоксидантными, антирадикальными свойствами и способностью устранять гипоксию [8]. Целью настоящей работы явилось изучение качественного и количественного содержания флавоноидов листьев вербены лимонной и проведение валидационной оценки предлагаемой методики количественного определения флавоноидов в сырье.

Объектом исследования служили листья вербены лимонной, заготовленные на территории Марокко в фазу массового цветения в июле 2019 года. Растительный материал был высушен воздушно-теневым способом. Лекарственное сырье представляло собой цельные или измельченные листья с  характерным цитрусовым запахом.

Исследование качественного состава флавоноидов проводили методом восходящей хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) в извлечениях, полученных спиртом этиловым 70%.  Хроматографические исследования осуществляли на пластинках «Sorbfil» марки ПТСХ-АФ-А-УФ, Россия в системе н-бутанол – кислота уксусная концентрированная – вода (4:1:2). В качестве стандартных образцов использовали 0,05% растворы рутина, лютеолина, кверцетина, кверцетрина, апигенина. Детекцию зон адсорбции флавоноидов осуществляли по их флуоресценции в УФ-свете при длине волны 365 нм до и после обработки хроматограмм парами аммиака и сравнивали их окраску и положение (величину Rf) с соответствующими зонами адсорбции стандартных образцов [2].

Количественное содержание суммы флавоноидов определяли дифференциальным фотометрическим методом  по реакции комплексообразования с раствором алюминия хлорида [2], [9], [10], [11]. Данный метод предусматривает использование в качестве контроля испытуемого раствора без реактивов, что позволяет исключить влияние окрашенных и сопутствующих веществ, а также веществ, не образующих комплекс с реактивами.

Методика определения. Точную навеску измельченного сырья массой около 1,0 г помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл, приливали 30 мл 70% этилового спирта, нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин с момента закипания спирта этилового в колбе. Экстракцию повторяли трижды в описанных выше условиях. После охлаждения полученные извлечения фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл (раствор А). 5 мл раствора А вносили в мерную колбу  вместимостью 50 мл,  добавляли 2 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида, 0,1 мл разведенной уксусной кислоты,  доводили до метки спиртом этиловым 96% и перемешивали (раствор В). Через 40 минут измеряли оптическую плотность раствора В относительно раствора сравнения (готовили аналогично раствору В, но без добавления раствора алюминия хлорида) на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны  400 нм (Ах) [2, 9-11].

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в листьях вербены лимонной (Х,%) вычисляли по формуле, используя значение удельного показателя поглощения лютеолина:

где:    А - оптическая плотность исследуемого раствора;

А1см1% - удельный показатель поглощения комплекса лютеолина с алюминия хлоридом при длине волны 400 нм, равный 549,41;

a - масса навеска сырья, г;

W - влажность сырья, %.

Методом ТСХ в системе растворителей н-бутанол – кислота уксусная концентрированная – вода (4:1:2) в листьях вербены лимонной обнаружено наличие зон адсорбции 6 веществ флавоноидной структуры, из которых были идентифицированы рутин (0,82), апигенин (0,78) и лютеолин (0,57) (табл. 1).

Наибольшей интенсивностью свечения характеризовалась зона адсорбции лютеолина, что позволило сделать вывод о преобладании в сырье данного вещества.

Спектры спиртовых извлечений из листьев вербены лимонной имели максимумы поглощения при длинах волн 286±2 нм и 333±2 нм, что свидетельствовало о присутствии в сырье помимо флавоноидов сопутствующих веществ (фенилпропаноида вербаскозида) [1], [2]. Мешающее влияние сопутствующих веществ нивелировали реакцией комплексообразования флавоноидов с раствором хлорида алюминия, дающей батохромный сдвиг спектра поглощения [2]. Дифференциальный спектр комплекса флавоноидов листьев вербены лимонной с алюминия хлоридом имел  максимум поглощения при длине волны 400 нм, что соответствовало максимуму поглощению комплекса лютеолина с алюминия хлоридом, поэтому целесообразно было вести расчет количественного содержания суммы флавоноидов в сырье в пересчете на лютеолин.  

Изучение факторов, влияющих на выход суммы флавоноидов из листьев вербены лимонной показало, что оптимальным является режим 3-кратной экстракции 70%-ным этиловым спиртом этиловым в течение 45 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:30 (табл. 2).

На основании полученных результатов была предложена методика количественного анализа флавоноидов в исследуемом сырье и проведена ее валидационная оценка по параметрам линейность, прецизионность и правильность.

Для оценки линейности методики строили градуировочный график на 8 уровнях концентраций. Растворы готовили путем изменения объема аликвоты извлечения из листьев вербены лимонной.  Концентрация флавоноидов в пересчете на лютеолин в анализируемых растворах составляла 0,005%, 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,035% и 0,04% (табл. 3). 

Рисунок 1 - Градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов

DOI:10.23670/IRJ.2022.122.109.4

В результате определения установлено, что график зависимости оптической плотности растворов от концентрации флавоноидов (рис.1) имеет линейный характер и описывается уравнением: y=25,87х-0,012. Коэффициент корреляции близок к  единице и составляет 0,996, что свидетельствует об удовлетворительной линейности методики.

Установление прецизионности проводили по результатам анализа одного образца извлечения листьев вербены лимонной в 6 повторностях. Затем вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относитель­ного стандартного отклонения (RSD) (табл. 4).

Из данных табл. 4 следует, что величина относительного стандартного отклонения составила 1,02%, что является удовлетворительным для данного метода. 

Главным фактором, определяющим правильность методики, является значение системати­ческой погрешности. Для определения правильности был выбран вариант, предлагаемый для биологических образцов, когда невозможно приготовить модельные смеси [10], [11], [12]. Правильность методики определяли методом добавок стандартного образца лютеолина к точной навеске сырья вербены лимонной (табл. 5). Для оценки полученных результатов использовали коэффициент открываемости (R), средняя величина которого должна находиться в пределах 100±5%. В разработанной методике критерий открываемости находился в пределах от 98,74% до 103,62%. Среднее его значение составило 100,95% (RSD=1,904%), что свидетельствует об удовлетворительной правильности методики количественного определения флавоноидов в листьях вербены лимонной.

В результате проведенного исследования нами установлено присутствие в листьях вербены лимонной флоры Марокко лютеолина, апигенина, рутина; предложены оптимальные условия извлечения суммы флавоноидов из сырья (3-кратная экстракции 70%-ным этиловым спиртом этиловым в течение 45 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:30); разработана методика количественного определения флавоноидов в листьях Aloysia citriodora;   проведена валидационная оценка разработанной методики, которая показала, что разработанная валидна по показателям линейность, воспроизводимость и правильность и пригодна для оценки качества листьев вербены лимонной.