FLAVONOIDS OF LEMON VERBENA LEAVES

Research article
DOI:
https://doi.org/10.23670/IRJ.2022.122.109
Issue: № 8 (122), 2022
Suggested:
09.08.2022
Accepted:
09.08.2022
Published:
17.08.2022
245
7
XML PDF

Abstract

Lemon verbena (Aloysia citriodora Palau) is a perennial shrub that grows in the wild in South America (Argentina, Brazil, Chile, Paraguay). The raw materials of lemon verbena are rich in essential oil, phenolic compounds (phenylpropanoids, flavonoids, tannins), saponins, polysaccharides, vitamins. The purpose of this work was a qualitative and quantitative study of flavonoid compounds of lemon verbena leaves. The object of this work was lemon verbena leaves gathered on the territory of Morocco in July 2019. The plant material was dried by air-shade method. The crude drugs were made of whole or crushed leaves with a particular fragrance. The method of chromatography in a thin layer of sorbent (TLS) was used to identify flavonoid compounds. Quantitative study of flavonoids was carried out using differential photometric analysis based on the ability of complex compounds of flavonoids with aluminum ions to absorb electromagnetic radiation in the ultraviolet region of the spectrum. As a result of the study, the qualitative composition of flavonoids, optimal conditions for the extraction of flavonoids from raw materials and their quantitative content in lemon verbena leaves as a percentage in terms of luteolin were established, a validation assessment of the methodology for the quantitative determination of flavonoids in the studied raw materials was carried out.

1. Введение

Листья вербены лимонной издревле широко применяются в народной медицине для лечения различных заболеваний [1], [4], [5], [6]. Вербена лимонная богата фенольными соединениями такими, как фенилпропаноиды, фенолокислоты, флавоноиды, дубильные вещества [7]. В настоящее время проводится интенсивное изучение биологических свойств полифенольных соединений, в частности, флавоноидов. Фармакологическое действие флавоноидов обусловлено их антиоксидантными, антирадикальными свойствами и способностью устранять гипоксию [8]. Целью настоящей работы явилось изучение качественного и количественного содержания флавоноидов листьев вербены лимонной и проведение валидационной оценки предлагаемой методики количественного определения флавоноидов в сырье.

2. Методы и принципы исследования

Объектом исследования служили листья вербены лимонной, заготовленные на территории Марокко в фазу массового цветения в июле 2019 года. Растительный материал был высушен воздушно-теневым способом. Лекарственное сырье представляло собой цельные или измельченные листья с  характерным цитрусовым запахом.

Исследование качественного состава флавоноидов проводили методом восходящей хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) в извлечениях, полученных спиртом этиловым 70%.  Хроматографические исследования осуществляли на пластинках «Sorbfil» марки ПТСХ-АФ-А-УФ, Россия в системе н-бутанол – кислота уксусная концентрированная – вода (4:1:2). В качестве стандартных образцов использовали 0,05% растворы рутина, лютеолина, кверцетина, кверцетрина, апигенина. Детекцию зон адсорбции флавоноидов осуществляли по их флуоресценции в УФ-свете при длине волны 365 нм до и после обработки хроматограмм парами аммиака и сравнивали их окраску и положение (величину Rf) с соответствующими зонами адсорбции стандартных образцов [2].

Количественное содержание суммы флавоноидов определяли дифференциальным фотометрическим методом  по реакции комплексообразования с раствором алюминия хлорида [2], [9], [10], [11]. Данный метод предусматривает использование в качестве контроля испытуемого раствора без реактивов, что позволяет исключить влияние окрашенных и сопутствующих веществ, а также веществ, не образующих комплекс с реактивами.

Методика определения. Точную навеску измельченного сырья массой около 1,0 г помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл, приливали 30 мл 70% этилового спирта, нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 45 мин с момента закипания спирта этилового в колбе. Экстракцию повторяли трижды в описанных выше условиях. После охлаждения полученные извлечения фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл (раствор А). 5 мл раствора А вносили в мерную колбу  вместимостью 50 мл,  добавляли 2 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида, 0,1 мл разведенной уксусной кислоты,  доводили до метки спиртом этиловым 96% и перемешивали (раствор В). Через 40 минут измеряли оптическую плотность раствора В относительно раствора сравнения (готовили аналогично раствору В, но без добавления раствора алюминия хлорида) на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны  400 нм (Ах) [2, 9-11].

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на лютеолин в листьях вербены лимонной (Х,%) вычисляли по формуле, используя значение удельного показателя поглощения лютеолина:

img

где:    А - оптическая плотность исследуемого раствора;

А1см1% - удельный показатель поглощения комплекса лютеолина с алюминия хлоридом при длине волны 400 нм, равный 549,41;

a - масса навеска сырья, г;

W - влажность сырья, %.

3. Основные результаты

Методом ТСХ в системе растворителей н-бутанол – кислота уксусная концентрированная – вода (4:1:2) в листьях вербены лимонной обнаружено наличие зон адсорбции 6 веществ флавоноидной структуры, из которых были идентифицированы рутин (0,82), апигенин (0,78) и лютеолин (0,57) (табл. 1).

Таблица 1 - Результаты хроматографического анализа флавоноидов в листьях вербены лимонной

R

Окраска зон адсорбции

Результаты идентификации/

предполагаемое вещество

в видимом свете

в УФ-свете

в УФ при 365 нм свете после обработки NH3

0,44±0,03

Коричневая

Коричневая

Коричневая

не идентифиц.

0,57±0,02

Коричневая

Темно-коричневая

Желто-коричневая

лютеолин

0,63±0,03

Коричневая

Коричневая

Коричневая

не идентифиц.

0,79±0,02

Светло-коричневая

Светло-бурая

Желтая

апигенин

0,82±0,02

Светло-коричневая

Светло-коричневая

Лимонно-желтая

рутин

0,91±0,02

Светло-коричневая

Светло-бурая

Оранжевая

не идентифиц.

Наибольшей интенсивностью свечения характеризовалась зона адсорбции лютеолина, что позволило сделать вывод о преобладании в сырье данного вещества.

Спектры спиртовых извлечений из листьев вербены лимонной имели максимумы поглощения при длинах волн 286±2 нм и 333±2 нм, что свидетельствовало о присутствии в сырье помимо флавоноидов сопутствующих веществ (фенилпропаноида вербаскозида) [1], [2]. Мешающее влияние сопутствующих веществ нивелировали реакцией комплексообразования флавоноидов с раствором хлорида алюминия, дающей батохромный сдвиг спектра поглощения [2]. Дифференциальный спектр комплекса флавоноидов листьев вербены лимонной с алюминия хлоридом имел  максимум поглощения при длине волны 400 нм, что соответствовало максимуму поглощению комплекса лютеолина с алюминия хлоридом, поэтому целесообразно было вести расчет количественного содержания суммы флавоноидов в сырье в пересчете на лютеолин.  

Таблица 2 - Факторы, оказывающие влияние на выход суммы флавоноидов

Концентрация этанола, % об.

Соотношение

сырья и экстрагента

Кратность экстракции

Время экстракции, мин

Содержание флавоноидов, %

40

1:20

1

45

0,795

50

1:20

1

45

0,823

70

1:20

1

45

0,905

70

1:30

1

45

1,140

70

1:40

1

45

1,002

70

1:50

1

45

0,967

70

1:30

2

45, 45

1,274

70

1:30

3

45, 45, 45

1,406

Изучение факторов, влияющих на выход суммы флавоноидов из листьев вербены лимонной показало, что оптимальным является режим 3-кратной экстракции 70%-ным этиловым спиртом этиловым в течение 45 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:30 (табл. 2).

На основании полученных результатов была предложена методика количественного анализа флавоноидов в исследуемом сырье и проведена ее валидационная оценка по параметрам линейность, прецизионность и правильность.

Для оценки линейности методики строили градуировочный график на 8 уровнях концентраций. Растворы готовили путем изменения объема аликвоты извлечения из листьев вербены лимонной.  Концентрация флавоноидов в пересчете на лютеолин в анализируемых растворах составляла 0,005%, 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,035% и 0,04% (табл. 3). 

Таблица 3 - Результаты измерения оптической плотности

C, %

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

0,04

А

0,125

0,260

0,328

0,510

0,650

0,780

0,885

1,019

Градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов

Рисунок 1 - Градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов

В результате определения установлено, что график зависимости оптической плотности растворов от концентрации флавоноидов (рис.1) имеет линейный характер и описывается уравнением: y=25,87х-0,012. Коэффициент корреляции близок к  единице и составляет 0,996, что свидетельствует об удовлетворительной линейности методики.

Установление прецизионности проводили по результатам анализа одного образца извлечения листьев вербены лимонной в 6 повторностях. Затем вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относитель­ного стандартного отклонения (RSD) (табл. 4).

Таблица 4 - Результаты определения прецизионности

Навеска, г

Оптическая плотность

Найдено флавоноидов в пересчете на лютеолин (Х, %)

Метрологические

характеристики

0,984

0,700

1,381

Хср =1,406%

SD = 0,0143

RSD = 1,02% 

1,004

0,731

1,414

0,988

0,724

1,423

1,010

0,728

1,400

1,000

0,725

1,408

0,994

0,720

1,407

Из данных табл. 4 следует, что величина относительного стандартного отклонения составила 1,02%, что является удовлетворительным для данного метода. 

Главным фактором, определяющим правильность методики, является значение системати­ческой погрешности. Для определения правильности был выбран вариант, предлагаемый для биологических образцов, когда невозможно приготовить модельные смеси [10], [11], [12]. Правильность методики определяли методом добавок стандартного образца лютеолина к точной навеске сырья вербены лимонной (табл. 5). Для оценки полученных результатов использовали коэффициент открываемости (R), средняя величина которого должна находиться в пределах 100±5%. В разработанной методике критерий открываемости находился в пределах от 98,74% до 103,62%. Среднее его значение составило 100,95% (RSD=1,904%), что свидетельствует об удовлетворительной правильности методики количественного определения флавоноидов в листьях вербены лимонной.

Таблица 5 - Результаты определения правильности

№ п/п

Флаво-

ноиды,

%

Добавлено лютеолина

к 1 г сырья

Содержание флавоноидов, %

R,%

Метрологические

характеристики

Найдено

Расчет-ное

1

1,406

0,005

1,975

1,906

103,62

R=100,95

2

1,406

0,0075

2,129

2,156

98,74

3

1,406

0,01

2,432

2,406

101,08

4

1,406

0,015

2,887

2,906

99,34

5

1,406

0,02

3,411

3,406

100,15

6

1,406

0,025

4,012

3,906

102,74

4. Заключение

В результате проведенного исследования нами установлено присутствие в листьях вербены лимонной флоры Марокко лютеолина, апигенина, рутина; предложены оптимальные условия извлечения суммы флавоноидов из сырья (3-кратная экстракции 70%-ным этиловым спиртом этиловым в течение 45 мин при соотношении сырья и экстрагента 1:30); разработана методика количественного определения флавоноидов в листьях Aloysia citriodora;   проведена валидационная оценка разработанной методики, которая показала, что разработанная валидна по показателям линейность, воспроизводимость и правильность и пригодна для оценки качества листьев вербены лимонной.

Article metrics

Views:245
Downloads:7
Views
Total:
Views:245