CELL PROLIFERATIVE| AND APOPTOSIS ACTIVITY IN DIFFERENT AREAS OF HUMAN SKIN IN EARLY EMBRYONIC HISTOGENESIS

Шаповалова Е. Ю.¹,  Бойко Т. А.², Барановский Ю.Г.³, Коломоец Т.А.⁴, Каракулькина О.А⁵

¹доктор медицинских наук, профессор; ²кандидат медицинских наук, доцент; ³кандидат медицинских наук, ассистент; ⁴аспирант; ⁵аспирант, ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского».

ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ И АПОПТОТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ  КЛЕТОК РАЗНЫХ УЧАСТКОВ КОЖИ У  ЧЕЛОВЕКА В ПРОЦЕССЕ  РАННЕГО ЭМБРИОНАЛЬНОГО ГИСТОГЕНЕЗА

Аннонация

Изучены 112 зародышей и плодов человека в возрасте от 21 суток до 12 недель внутриутробного развития с целью выявления особенностей развития кожи в различных участках. Иммуногистохимически выявлены индекс  пролиферации Ki-67-позитивные клетки), индекс апоптоза (р53-позитивные клетки), индекс готовности к апоптозу (CD95-позитивные клетки) и антиапоптотический индекс (Bcl-2-позитивные клетки) клеток кожи головы и тела. Эпидермис кожи проявляет свойства растущей и обновляющейся клеточной популяции с высокими индексами пролиферации, апоптоза и антиапоптотическим индексом. Данные индексы в эпидермисе кожи головы несколько выше. Мезенхима и эмбриональная соединительная ткань дермы кожи имеет свойства растущей клеточной популяции с высоким антиапоптотическим индексом и индексом пролиферации, что позволяет осуществляться формообразовательным процессам и дифференцировке. Индекс апоптоза значительно ниже. Опережающее развитие дермы кожи головы подкрепляется более высокими изученными показателями. Индекс готовности к апоптозу мал и стабилен во всех структурах кожи. Механизмы поддержания нарастания клеточной массы по мере роста зародышей и плодов в эпидермисе и дерме разные. В эпидермисе высока пролиферативная и апоптотическая активность при таком же высоком антиапоптотическом индексе. В дерме клеточная масса увеличивается активнее за счет высокого индекса пролиферации и намного более низкого индекса апоптоза при очень высоком антиапоптотическом индексе.

Ключевые слова: пренатальный органогенез кожи, плоды человека, апоптоз, пролиферация.

 Shapovalova Ye.Yu.¹, Boyko T.A.², Baranovskiy Yu.G.³, Kolomoyetz T.A.⁴, Karakulkina O.A.⁵

¹PhD in Medicine, Professor; ²Assosiate professor; ³Assistant professor; ⁴Postgraduate student; ⁵Postgraduate student, Crimean Federal University named after V.I.Vernadsky.

CELL PROLIFERATIVE| AND APOPTOSIS ACTIVITY  IN DIFFERENT AREAS OF HUMAN SKIN IN EARLY EMBRYONIC HISTOGENESIS

Abstract

In 112 human embryos and fetus in the age from 21 day to 12 weeks of the intrauterine development index of proliferation (Ki-67- positive cells), index of apoptosis (р53 - positive cells), index of readiness to the apoptosis (CD95 - positive cells) and antiapoptosis index (Bcl-2 -positive cells) of skin cells with the purpose of exposure of skin development in different areas have been revealed. The epidermis of skin shows properties of growing and brushing up cellular population with the high indexes of proliferation, apoptosis and antiapoptosis index. These indexes in the epidermis of head skin are few higher. Mesenchyme and embryonic connective tissue of skin dermis has characteristics of growing cellular population with a high index of proliferation and antiapoptosis index, that allows to be carried out processes of formation  and differatiation. The index of apoptosis considerably below. Passing ahead development of head dermis refreshes oneself more high studied indexes. The index of readiness to the apoptosis is small and stable in all skin structures. Mechanisms of maintenance of epidermis and dermis cellular mass growth in embryos and fetus differ. In an epidermis cellular proliferative, apoptotic and antiapoptotic  activity is high. In dermis cellular mass is increased more active due to the high index of proliferation and far more low index of apoptosis at an ever-higher antiapoptosis index.

Key words: skin prenatal organogenesis, human fetus, apoptosis, proliferation|.

В основе пренатального развития органов человека, в том числе и кожи, лежит эмбриональный гистогенез. Согласно классическим представлениям любой гистогенез представляет собой динамически организованную систему и включает в качестве базисных механизмов процессы клеточной и тканевой детерминации, роста, клеточной дифференцировки, пролиферации и гибели клеток, миграции и межклеточной интеграции [3, 4]. Генетически запрограммированная клеточная смерть (апоптоз) является неотъемлемой частью развития эмбриона и плода, как и функционирования взрослого организма [6, 10]. Эта выборочная или изолированная гибель клетки управляется ее геномом [8]. Апоптоз важен для поддержания оптимального баланса между старыми нефункционирующими клетками и вновь образованными в результате пролиферации [7, 10]. Также следует считать апоптоз эффективным способом удаления клеток с генетическими повреждениями. Сведения об активности пролиферативных и апоптотических процессах клеток кожи человека в первом триместре органогенеза отрывочны, скудны и не отражают особенности развития кожи в различных участках.

Целью и задачей нашего исследования явилось изучение индекса пролиферации, индекса готовности к апоптозу, индекса апоптоза и антиапоптотического индекса клеток кожи головы и тела у зародышей и плодов человека.

Материал и методы. Изучены 112 зародышей человека в возрасте от 21 суток до 12 недель внутриутробного развития на стадиях последовательно от раннего периода нервного желобка до начала дефинитивного плодного периода. Эмбрионы и плоды быстро фиксировали 10% забуференным нейтральным формалином сразу же после операции abrasio. Материал заливали в парафин и из них изготовляли серийные срезы толщиной 5-6 мкм. Иммуногистохимические реакции проводили в парафиновых срезах кожи головы и тела с использованием соответствующих первичных антител Ki-67, CD 95 / Apo 1, Bcl-2 и p53 (DAKO) и системы визуализации En vision (DAKO). Ядра докрашивали гематоксилином. Тепловое демаскирование антигенов проводили в микроволновой печи Samsung М 1915 NR при фиксированной мощности 800 Вт в течение 2 минут. Индекс апоптоза клеток кожи был оценен с помощью моноклональных антител к протеину р53, который играет центральную роль в развитии апоптоза [2]. Кроме того, для оценки готовности клеток эпидермиса и дермы к рецепторному апоптозу и вычисления индекса готовности к апоптозу использовали моноклональные антитела к Fas-рецепторам (CD 95 / Apo 1). Антиапоптотический индекс определяли с помощью моноклональных антител к антиапоптотическому белку Bcl-2, который пролонгирует жизнь клетки, блокируя апоптоз. Индекс пролиферации, готовности к апоптозу, индекс апоптоза, антиапоптотический индекс получали путем подсчета количества  Ki-67, CD 95 / Apo 1, p53 и Bcl-2-позитивных клеток на 100 клеток соответствующих структур кожи при увеличении х1350 с последующим вычислением показателя в процентах.

Результаты и обсуждение. До 38-ми суток (10 мм длины) у зародышей прослеживается однослойный эктодермальный покров, формирующий в дальнейшем эпидермис кожи. На пятой неделе становится заметным опережающее развитие кожи головы по сравнению с туловищем. Индексы пролиферации и апоптоза клеток эпидермиса кожи головы сравнительно высоки и находятся примерно на одном уровне  (40,71+0,35 и 38,60+0,28) (рис. 1),  что позволяет отнести эпидермис к обновляющейся клеточной популяции [3]. Те же индексы в эпидермисе кожи туловища несколько меньше, хотя разница не выходит за 4,5%. СD95-позитивные клетки в коже головы и туловища (индекс готовности к апоптозу) не многочисленны. Экспрессия гена Bcl-2, препятствующая вступлению клеток в апоптоз, высока в клетках эпидермиса, особенно эпидермиса головы. Высокие показатели индекса пролиферации и антиапоптотического индекса свидетельствует об активных процессах формообразования и последующей дифференцировке  [9]. По А. А. Клишову [3] – это растущая клеточная популяция. На этом основании можно отнести эпидермис кожи головы и туловища к растущей и одновременно обновляющейся клеточной популяции. В предыдущих работах сотрудников нашей лаборатории, касающихся органогенеза дефинитивных органов – поджелудочной железы [5] и метанефроса [1] и провизорного органа – мезонефроса [1] такие смешанные популяции не были обнаружены.

Рис. 1 - Индексы пролиферации (Ki-67), апоптоза (p53), готовности к апоптозу (CD95) и антиапоптотический индекс (Bcl-2) клеток эпидермиса головы (ЭГ) и туловища (ЭТ).

В последующие сроки развития эпидермиса прослеживается постепенное незначительное снижение значений всех изученных показателей. В эпидермисе кожи туловища индекс апоптоза во всех возрастах выше, чем в эпидермисе головы, а индекс пролиферации наоборот. За счет более высокого индекса пролиферации и антиапоптотического индекса и более низкого индекса апоптоза эпидермис кожи головы быстрее наращивает слойность, хотя готовность к апоптозу клеток эпидермиса головы выше, чем эпидермоцитов туловища.

Дерма кожи головы и туловища до 45 суток (зародыши 16 мм длины) представлена неуплотненной мезенхимой, формирующей синцитий из отростчатых клеток. В головной части зародышей мезенхима несколько более уплотнена по сравнению с дермой туловищной части зародышей, хотя изученные показатели одинаковы. Среди клеток мезенхимы дермы кожи головы и туловища наиболее часто встречаются клетки с экспрессией антиапоптотического гена Bcl-2 (рис. 2). Их индекс равен 41,41+0,31. Индекс пролиферации тех же клеток также высок и составляет 37,25+0,24.  Индекс апоптоза значительно ниже (26,32+0,16), индекс готовности к апоптозу мал и составляет  7,78+0,14. На данном этапе мезенхима – растущая клеточная популяция, в которой имеются предпосылки к формообразованию и дифференцировке.

На последующих этапах развития образовавшаяся из мезенхимы эмбриональная соединительная ткань (ЭСТ) дермы головы и туловища продолжает демонстрировать признаки растущей клеточной популяции, где нарастание клеточной массы происходит за счет более высокого индекса пролиферации и более низкого индекса апоптоза при высокой экспрессии гена Bcl-2. Готовность клеток к рецепторному апоптозу стабильно мала. В дерме кожи головы все изученные показатели несколько выше. В то же время с возрастом эти показатели медленно, но неуклонно снижаются, как в дерме кожи головы, так и туловища.

Рис. 2 - Индексы пролиферации (Ki-67), апоптоза (p53), готовности к апоптозу (CD95) и антиапоптотический индекс (Bcl-2) клеток мезенхимы или ЭСТ дермы кожи головы (МГ) и туловища (МТ).

Выводы.

1. Эпидермис кожи проявляет свойства растущей и обновляющейся клеточной популяции с высокими индексами пролиферации, апоптоза и антиапоптотическим индексом. Данные индексы в эпидермисе кожи головы несколько выше.
2. Мезенхима и ЭСТ дермы кожи имеет свойства растущей клеточной популяции с высоким антиапоптотическим индексом и индексом пролиферации, что позволяет осуществляться формообразовательным процессам и дифференцировке. Индекс апоптоза значительно ниже. Опережающее развитие дермы кожи головы подкрепляется более высокими изученными показателями. Индекс готовности к апоптозу мал и стабилен во всех структурах кожи.
3. Механизмы поддержания нарастания клеточной массы по мере роста зародышей и плодов в эпидермисе и дерме разные. В эпидермисе высока пролиферативная и апоптотическая активность при таком же высоком антиапоптотическом индексе. В дерме клеточная масса увеличивается активнее за счет высокого индекса пролиферации и намного более низкого индекса апоптоза при очень высоком антиапоптотическом индексе.

Литература

1. Бойко Т.А. Апоптоз и пролифирация клеток обеспечивает расцвет и редукцию первичной почки у эмбрионов человека / Т.А. Бойко, Е.Ю. Шаповалова // Таврический медико-биологический вестник. – 2009. – Т. 12, № 4. – С. 15-18.
2. Цыган В.Н. Введение в методологию исследования апоптоза при онкологических заболеваниях / В.Н. Цыган, А.М. Иванов, В.А. Бубнов [и др.]. – СПб.: ВмедА., 2010. – 64 с.
3. Клишов. А. А. Гистогенез и регенерация тканей / А. А. Клишов. – Л.: Медицина, 1984. – 232 с.
4. Кнорре А. Г. Эмбриональный гистогенез (морфологичес­кие очерки) / Кнорре А. Г. – Л.: Медицина, 1971. – 432 с.
5. Майструк Н.И. Особенности клеточной пролиферации и гибели в процессе  раннего эмбрионального гистогенеза первичной почки и  поджелудочной железы у зародышей человека / Н.И. Майструк, Т.А. Бойко, Е.Ю. Шаповалова, И.А. Демьяненко // Вісник морфології. – 2010. – Т. 16, № 2. – С. 307-312.
6. Майструк Н.И. Органные особенности пролиферации и апоптоза клеток поджелудочной железы у зародышей человека при маточной имплантации \ Н.И. Маструк, Е.Ю. Шаповалова // Таврический медико-биологический вестник. – 2009. – Т. 12, № 4. – С. 121-124.
7. Милованов А. П. Внутриутробное развитие человека / А. П. Милованов, С. В. Савельева. – Москва, 2006. – 382 с.
8. Цымбалюк В. И. Нейрогенные стволовые клетки / В. И. Цымбалюк, В. В. Медведев. – К.: «Коваль», 2005. – 596 с.
9. Fesus L. P. Apoptosis; Molecular mechanisms in programmed cell death / L. P. Fesus, J. A. Davis, M. Piacentini // Europ. J. Cell Biol. – 1991. – Vol. 747. – P. 195-204.
10. Zusman I. Immune systems and human intrauterine development / Itzhak Zusman, Pavel Gurevich, Herzel Ben-Hur. – Transworld Research Network: Kerala, India, 2008. – 239 p.

 References

1. Bojko T.A. Apoptoz i prolifiracija kletok obespechivaet rascvet i redukciju pervichnoj pochki u jembrionov cheloveka / T.A. Bojko, E.Ju. Shapovalova // Tavricheskij mediko-biologicheskij vestnik. – 2009. – T. 12, № 4. – S. 15-18.
2. Cygan V.N. Vvedenie v metodologiju issledovanija apoptoza pri onkologicheskih zabolevanijah / V.N. Cygan, A.M. Ivanov, V.A. Bubnov [i dr.]. – SPb.: VmedA., 2010. – 64 s.
3. Klishov. A. A. Gistogenez i regeneracija tkanej / A. A. Klishov. – L.: Medicina, 1984. – 232 s.
4. Knorre A. G. Jembrional'nyj gistogenez (morfologiches­kie ocherki) / Knorre A. G. – L.: Medicina, 1971. – 432 s.
5. Majstruk N.I. Osobennosti kletochnoj proliferacii i gibeli v processe rannego jembrional'nogo gistogeneza pervichnoj pochki i podzheludochnoj zhelezy u zarodyshej cheloveka / N.I. Majstruk, T.A. Bojko, E.Ju. Shapovalova, I.A. Dem'janenko // Vіsnik morfologії. – 2010. – T. 16, № 2. – S. 307-312.
6. Majstruk N.I. Organnye osobennosti proliferacii i apoptoza kletok podzheludochnoj zhelezy u zarodyshej cheloveka pri matochnoj implantacii \ N.I. Mastruk, E.Ju. Shapovalova // Tavricheskij mediko-biologicheskij vestnik. – 2009. – T. 12, № 4. – S. 121-124.
7. Milovanov A. P. Vnutriutrobnoe razvitie cheloveka / A. P. Milovanov, S. V. Savel'eva. – Moskva, 2006. – 382 s.
8. Cymbaljuk V. I. Nejrogennye stvolovye kletki / V. I. Cymbaljuk, V. V. Medvedev. – K.: «Koval'», 2005. – 596 s.
9. Fesus L. P. Apoptosis; Molecular mechanisms in programmed cell death / L. P. Fesus, J. A. Davis, M. Piacentini // Europ. J. Cell Biol. – 1991. – Vol. 747. – P. 195-204.
10. Zusman I. Immune systems and human intrauterine development / Itzhak Zusman, Pavel Gurevich, Herzel Ben-Hur. – Transworld Research Network: Kerala, India, 2008. – 239 p.