COMPARATIVE REVIEW OF POSSIBILITIES OF DANIO RERIO (ZEBRAFISH) USAGE AS A MODEL OBJECT IN PRECLINICAL STUDIES

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ОБЗОР ВОЗМОЖНОСТЕЙ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ DANIO RERIO (ZEBRAFISH) В КАЧЕСТВЕ МОДЕЛЬНОГО ОБЪЕКТА В ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Научная статья

Качанов Д.А.^1, *, Бардаков М.О.², Лукин Е.Н.³, Мкртчян Г.В.⁴, Газданова Н.В.⁵, Акопян К.А.⁶, Евстратова А.В.⁷, Бадальянц Д.А.⁸, Хачатрян А.В.А.⁹, Шахназарян Р.Л.¹⁰, Арушанова Э.А.¹¹

¹ ORCID: 0000-0003-1528-1899;

^1-10 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова Минздрава России, г. Санкт-Петербург, Россия;

¹¹ Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова Минздрава России, г. Санкт-Петербург, Россия

* Корреспондирующий автор (Dmitrii.Kachanov[at]szgmu.ru)

Аннотация

Danio rerio (Zebrafish) как модельный объект в доклинических исследованиях применяются в последние годы очень широко. Этому способствуют их морфологические, физиологические, биохимические, генетические и эмбриологические особенности, а также экономическая выгода и небольшие временные затраты на их разведение. Цель – обобщение имеющихся данных об использовании Danio rerio (Zebrafish) в доклинических исследованиях. Методы. В данной работе проведён мета-анализ отечественных и зарубежных статей о применении Danio rerio в токсикологических, фармакологических, эмбриологических и др. направлениях исследований. Результаты. Danio rerio (Zebrafish) могут использоваться во многих направлениях доклинических исследований лекарственных препаратов. Особенно интересно их применение для моделирования стресса новизны и экспериментальной депрессии. Выводы. Danio rerio представляют собой универсальный модельный объект, позволяющий экономически выгодно проводить исследования различных фармакологических препаратов, прежде чем они будут тестироваться на других моделях, в частности млекопитающих.

Ключевые слова: Danio rerio, Zebrafish, модельный объект, доклинические испытания.

COMPARATIVE REVIEW OF POSSIBILITIES OF DANIO RERIO (ZEBRAFISH) USAGE AS A MODEL OBJECT IN PRECLINICAL STUDIES

Research article

Kachanov D.A.^1, *, Bardakov M.O.², Lukin E.N.³, Mkrtchjan G.V.⁴, Gazdanova N.V.⁵, Akopjan K.A.⁶, Evstratova A.V.⁷, Badal'janc D.A.⁸, Hachatrjan A.V.A.⁹, Shahnazarjan R.L.¹⁰, Arushanova Je.A.¹¹

¹ORCID: 0000-0003-1528-1899;

^1-10 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Ministry of Health of Russia, St. Petersburg;

¹¹ Pavlov First St. Petersburg State Medical University, Ministry of Health of Russia, St. Petersburg

* Corresponding author (Dmitrii.Kachanov[at]szgmu.ru)

Abstract

Danio rerio (Zebrafish) has been used very widely as a model object in preclinical studies in recent years. This is due to their morphological, physiological, biochemical, genetic and embryological features, as well as economic benefits and the small time spent on their breeding. The goal is to compile available data on the use of Danio rerio (Zebrafish) in preclinical studies. Methods: the authors use the meta-analysis of domestic and foreign articles on the use of Danio rerio in toxicological, pharmacological, embryological and other areas of research. Results: Danio rerio (Zebrafish) can be used in many areas of preclinical drug research. Their use for modeling novelty stress and experimental depression is of particular interest. Conclusions. Danio rerio is a universal model object, that allows cost-effective studies of various pharmacological preparations before they are tested on other models, in particular mammals.

Keywords: Danio rerio, Zebrafish, model object, preclinical trials.

Введение

На сегодняшний день достоверно известно, что тропические рыбки Danio rerio (Zebrafish) являются изученным и практичным модельным объектом доклинических исследований. Они имеют ряд преимуществ по сравнению с различными представителями данного класса и даже другими лабораторными животными, в частности грызунами. Благодаря детальной изученности эмбриогенеза, генома, морфологических особенностей и минимальности затрат на содержание Zebrafish может применяться в биологических, генетических, фармакологических исследованиях и скрининге при мутагенезе, оценке тератогенности и другого воздействия химических веществ. По сравнению с другими модельными объектами, такими как плодовая мушка Drosophila melanogaster и червь Caenorhabditis elegance, между геном человека и рыбки Zebrafish установлена сильная консервативная связь. Это делает тропическую рыбку отличной моделью для изучения комплексных биологических процессов таких как развитие нервной, сердечно-сосудистой и гемопоэтической систем, а также ангиогенеза, апоптоза и токсических эффектов влияния различных факторов [1], [2]. К настоящему времени уже получены сотни генетических мутантов Danio rerio, фенотип которых напоминает и может быть клиническим эквивалентом заболеваний у человека. Также получено несколько химерных моделей с рецепторами и сигнальными молекулами человека. Гены, кодирующие определённые рецепторы и сигнальные молекулы, как правило, связаны с развитием кардиоваскулярной патологии, заболеваниями кроветворной, нервной систем, миопатиями и миодистрофиями, что позволяет анализировать эффективность перспективных лекарственных препаратов [1], [2], [3]. В связи с этим использование Danio rerio как экспериментальной модели представляется особенно перспективным направлением в фармакологии.

Цель данного исследования - обобщение имеющиеся данных об использовании Zebrafish в доклинических исследованиях, установление их преимуществ и недостатков в конкретных лабораторных испытаниях и дальнейших перспективах работы с данным модельным объектом, что позволит считать его первым этапом доклинических исследований, перед тем как они будут проведены, например, на грызунах.

Материалы и методы

В работе был проведен мета-анализ данных зарубежных и отечественных статей (за период 2014-2018 гг.), посвященных использованию Danio rerio в различных доклинических исследованиях.

Результаты исследования

Danio rerio (Zebrahish) – маленькая пресноводная тропическая рыбка, населяющая преимущественно реки и ручьи Пакистана, Индии, Бангладеша, Непала, Мьянмы и Бутана. Zebrafish, хорошо известная любителям аквариумных рыб, широко применяется в лабораторных исследованиях. Danio rerio имеет продолговатую форму тела, основной тон окраски - серебристый с ярко синими и желто-зелеными полосами. Взрослые особи, обитающие на воле, достигают длины 6-7 см, аквариумные обитатели - 5 см. Zebrafish ведут стайный образ жизни (не менее 7-10 рыбок), большую часть времени держатся в верхних и средних слоях воды. В неволе живут около трех лет.

Главными достоинствами этой рыбки является наличие прозрачного эмбриона, который позволяет в полной мере наблюдать стадии эмбриогенеза. Данная особенность нашла применение в изучении тератогенного, канцерогенного и других влияний различных химических и лекарственных веществ на Danio rerio, что проявляется в нарушении этапов развития зародыша или формировании морфологических аномалий развития. Помимо этого, Zebrafish обладает высокой плодовитостью и быстрым периодом созревания эмбрионов. Через 3 дня после оплодотворения у него начинает функционировать сердце, кровеносная и нервная системы. На четвертые сутки происходит формирование малька, способного к самостоятельному питанию и движению. Эта особенность позволяет ускорить процесс исследования и минимизировать затраты в виде средств и времени [1].

Также стоит отметить, что на настоящее время проведено детальное изучение генома Danio rerio. Отмечается, что у Zebrafish имеется 70% гомологии с геномом человека, что позволяет их использовать как прекрасную модель для генетических исследований [1].

Сходные биохимические процессы с млекопитающими вновь подтверждают целесообразность использования Danio rerio как модели доклинических исследований.

Модельный объект для постановки стресса и депрессии

В настоящее время Zebrafish также активно используются в качестве опытной модели для постановки стресса новизны и экспериментальной депрессии с последующим воздействием препаратов разных фармакологических групп [1], [2], [3]. Для постановки стресса новизны используют следующую методику: Danio rerio помещают сначала в мерный стакан с растворенным веществом (или просто с чистой водой), а затем — в просмотровый аквариум на 6 минут, где автоматически регистрируются траектория движения, длина пути, число перемещений в верхнюю часть аквариума, время пребывания в нижней части аквариума, число и время паттерна «фризинг» (обездвиживание) за каждую минуту эксперимента. В ответ на новизну помещения Danio rerio реагируют погружением на дно, увеличением фризинга и снижением числа перемещений в верхнюю половину аквариума. Так, например, на фоне введения феназепама число и время паттерна «фризинг», а также время пребывания в нижней части аквариума снижались более чем в 2 раза по сравнению с контрольной группой и проявлялся дозозависимый эффект. Тест стресса новизны является высоко чувствительным для изучения тревожно-фобических реакций у Zebrafish, и данная модель может использоваться в доклинических исследованиях [1], [2].

Для создания экспериментальной депрессии может использоваться и другая модель, заключающаяся в разлучении особей Danio rerio по парам в ограниченном пространстве. Данная модель может являться перспективной для изучения уже существующих психоактивных веществ, а также в доклинических исследованиях новых препаратов [3].

Оценка токсичности фармакологических препаратов различных групп

В исследовании Sílvia Ribeiro и соавт. эмбрионы Danio rerio подвергались воздействию препаратов разных фармакологических групп: диклофенака, пропранолола, симвастатина и сертралина. Оценивалось их токсическое воздействие на эмбрионы Zebrafish. При оценке влияния диклофенака на эмбрионы наблюдались значительные изменения в развитии: рост аномальных клеток, нарушение стадии эпиболии в развитии зародыша, а также отклонения в формировании желточного мешка. Наиболее существенные нарушения развития были отмечены при концентрации препарата 12,5 мг/л. Число успешно пройденных стадий эпиболии в развитии зародыша уменьшилось с 91% до 82,5% при увеличении концентрации диклофенака с 1,25 до 12,5 мг/л.

При воздействии пропранолола в концентрации 12,5 мг/л выявлялось развитие перикардиального выпота, аномалий развития плавников, резко увеличивалась смертность эмбрионов с 32 по 80 часы исследования.

Сертралин в концентрации 10 мг/л приводил к смерти всех эмбрионов к 80 часам исследования. Также было показано значительное снижение успешных стадий эпиболии в развитии зародыша по сравнению с контролем (с 90% до 67,5 %).

Симвастатин оказался самым токсичным из исследуемых препаратов. Концентрация 5 мг/л оказалась смертельной для всех эмбрионов с 32 по 80 часы исследования.

В концентрации до 500 мкг/л данный препарат вызывал увеличение количества аномальных эмбрионов с нарушениями зрения, развития хвоста и желточного мешка, а также в полости перикарда рыбок развивался выпот.

Исследование показало, что эмбрионы Danio rerio могут использоваться как модель в проведении доклинических исследований по оценке токсичности различных новых фармацевтических препаратов [3].

В работе К.В. Золотарева и соавт. взрослые рыбы Danio rerio в течение 4 суток подвергались действию Cd и Cu, концентрации которых были равны ПДК(5 мкг/л для обоих ионов) и сублетальным концентрациям(6,4 мг/л для кадмия и 80 мкг/л для меди).Исследование действия ионов тяжелых металлов на протеом проводилось методом ВЭЖХ-масс-спектрометрии.

По итогам эксперимента были найдены маркеры токсического действия Cd и Cu на печень и сердечную мышцу (таблица 1) [4].

 

Таблица 1 – Маркеры токсического воздействия Cd и Cu на печень и сердечную мышцу, установленные при проведении исследований на Danio rerio

Ткань	Маркеры
	Cd	Cu
Печень	Сульфотрансфераза 3 семейства 2, фермент защитного и гидрофилизирующего действия	Eif2s1, субъединица 1 фактора 2 инициации трансляции генов. Образует комплекс с ГТФ и инициирующей т-РНК
	Секреторная фосфолипаза А2, Ca-зависимый фермент гидролиза фосфолипидов	Stat3, сигнальный белок-активатор транскрипции генов
сердце	НАДН-ДГ(убихинон)	Шаперонин класса 2
		Селенопротеин J, белок антиоксидантного действия

 

Модель для создания транспортных лекарственных систем

Danio rerio активно используются для разработки новых транспортных лекарственных систем, которые в дальнейшем помогут в лечении различных заболеваний. В частности, весьма актуальным является моделирование опухоли головного мозга Zebrafish с последующей ее терапией с помощью доксорубицина и паклитаксела, встроенных в экзосому [6].

Модель оценки влияния наркотических веществ

 Danio rerio могут служить прекрасными тест-объектами для моделирования влияния наркотических препаратов на организм Danio и дальнейших способов его фармакологической корректировки. Именно это сумели доказать в своем исследовании Eric J. Mercero, Shelby L. Poitra, Ana Espinoza и соавторы. При измерении электрокардиограммы подверженных воздействию кокаина рыбок Danio rerio наблюдалось увеличение ЧСС в колоколообразной зависимости от дозы. Максимальное увеличение проявлялось при дозировке 5 мг/л у большинства рыб в сравнении с базовой частотой. Также стоит отметить, что при воздействии более высоких доз у Zebrafish регистрировалась брадикардия. На основании проделанной работы была введена закономерность о том, что влияние кокаина на частоту сердечных сокращений обладает дозозависимым эффектом. Это в очередной раз подтверждает использование Danio rerio в качестве модельной системы для изучения влияния наркотических веществ [7].

Использование эмбрионов Danio rerio

Эмбрионы Zebrafish являются хорошей моделью для оценки влияния различных веществ на развитие и стимуляцию ооцитов.

В ранее проведенных экспериментах было показано, что для стимуляции овуляции у костистых рыб, как и других позвоночных необходимы эйкозаноиды (ПГF2α или ПГЕ2).

В исследовании М.Н.Скоблиной и соавт. впервые было показано, что достигшие дефинитивного размера окруженные фолликулярными оболочками ооциты Danio rerio, созревшие in vitro под влиянием прогестерона, овулируют в результате их обработки ПГF2α и полостной жидкостью карпа (ПЖК).

В проведенных опытах при обработке фолликулов Zebrafish прогестероном и ПГF2α (5 мкг/мл) после оплодотворения дробилось от 57 до 92% овулировавших ооцитов и от 17 до 61% из них достигало стадии вылупившейся личинки.

В результате воздействия на фолликулы 20% ПЖК, содержащей ПГF2α, было выявлено, что проценты овулировавших ооцитов Danio rerio, стимулированных прогестероном и ПЖК и прогестероном и простагландином у трех из четырех самок не отличаются достоверно [5].

Доклиническое исследование нуклеоспермата натрия («Вирутер») на эмбрионах Danio rerio показало, что при добавлении данного препарата в экспериментальные лунки с эмбрионами происходит их более эффективное развитие благодаря активации системы врожденного иммунитета с дальнейшим развитием комплекса регулируемых цитокинами провоспалительных и противовоспалительных сигналов [8].

Можно сделать вывод о том, что ооциты Zebrafish являются перспективной моделью для исследования роли различных соединений на процессы созревания клеток и овуляции.

Исследования гормонопрепаратов

Заболевания щитовидной железы относятся к числу наиболее распространенных нарушений в работе эндокринной системы. Нарушения ее функции встречаются часто, как у детей, так и у взрослых. Недостаток синтеза и секреции гормонов в раннем возрасте ведет к задержке роста, соматическим нарушениям и олигофрении (кретинизму), в более старшем возрасте – к замедлению обмена веществ (микседеме). С использованием рыбок Danio rerio можно проводить оценку влияния гипо- и гипертиреоидного состояния на развитие и выживаемость икринок до появления личинок, регистрируя при этом кровообращение, пигментацию зоны глаз, появление или отсутствие различных аномалий в развитии формы тела [9].

Использование Danio rerio для моделирования болезней человека

В ходе большого количества исследований у Danio rerio были идентифицированы гены, связанные с болезнями человека. К таким заболевания относятся болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофических склероз, мышечная дистрофия, лейкемия, тромбоз, кардиомиопатия, диабет и др. Для моделирования на Danio rerio этих заболеваний используют различные подходы. Так, например, нейротоксин – 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин, применяется для моделирования паркинсонизма у рыбок, так как механизм действия этого соединения, связанный с разрушением дофаминергических нейронов, у Danio rerio и млекопитающих один и тот же [10].

Выводы

В настоящее время большое количество лабораторий всего мира используют Zebrafish в своих исследованиях. Эти небольшие рыбки обладают несомненными преимуществами перед грызунами: относительно невысокая стоимость работ, небольшие временные затраты и простота в разведении. Данный модельный объект способствует не только созданию новых лекарственных препаратов, но и позволяет на основе созданных моделей болезней человека более подробно изучать их патогенез, а также влияние на органы и системы.  Модель Danio rerio не заменяет классических модели млекопитающих, она может первым этапом доклинических исследований, перед тем как они будут проведены, в частности, на грызунах.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Шабанов П.Д. Влияние стресса новизны на поведенческие ответы Danio rerio и оценка дозозависимых эффектов анксиолитиков бензадиазепинового ряда на примере феназепама / П.Д. Шабанов, В.А. Лебедев, А.А. Лебедев и др. // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2017. – Т. 15. - №3. – С. 57-63. dol: 10.17816/RCF15357-63
2. Качанов Д.А. Сравнительный анализ влияния селективных ингибиторов обратного захвата серотонина на поведение Danio rerio в условиях экспериментальной депрессии. // Мечниковские чтения-2018: материалы Всероссийской научно-практической студенческой конференции с международным участием. – СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова. – 2018. – С. 636-637.
3. Silvia Ribeiro Toxicity screening of Diclofenac, Propranolol, Sertraline and Simvastatin using Danio rerioand Paracentrotus lividus embryo bioassays / Silvia Ribeiro, Tiago Torres, Rosario Martins et al. // Ecotoxicology and Environmental Safety. – 2015. – P. 67-74
4. Золотарёв К.В. Поиск маркёров токсического действия CD2+ и Cu2+ методом протеомного профилирования печени и сердца Danio rerio / К.В. Золотарёв, Н.Ф. Беляева, М.В. Михайлова и др // Биотехнология и медицина. – 2015.
5. Скобкина М.Н. Гормональная индукция созревания и овуляции in vitro овоцитов Данио рерио (Danio rerio) и получение яйцеклеток, способных к оплодотворению и развитию / М.Н. Скобкина, А.А. Минин // Онтогенез. – 2016. – Т. 47. - №5. – С. 314-319
6. Yang, T. Pharm Res / T Yang,., P Martin,., B. Fogarty, et al.  (2015) 32: 2003. https://doi.org/10.1007/s11095-014-1593-y
7. Eric J. Mercero The effect of cocaine on heart rate and electrocardiogram in Danio rerio / Eric J. Mercero, Shelby L. Poitra, Ana Espinoza et al // Biochem Physiol С Toxicol Pharmacol. – 2015. – Р.1-6. - DOI: 10.1016 / j.cbpc.2015.03.007.8.
8. Блаженко А.А. Доклиническое исследование нуклеоспермата натрия на модели Danio rerio / А.А. Блаженко, Д.А Качанов, С.Н. Прошин // Мечниковские чтения-2018: материалы Всероссийской научно-практической студенческой конференции с международным участием. – СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова. – 2018. – С. 630-631.9.
9. Блаженко А.А. Исследование гормонопрепаратов на модели Danio rerio (Zebrafish). / А.А. Блаженко, Д.А Качанов, С.Н. Прошин // Мечниковские чтения-2018: материалы Всероссийской научно-практической студенческой конференции с международным участием. – СПб.: Изд-во СЗГМУ им. И. И. Мечникова. – 2018. – С. 633-634.10.
10. Беляева Н.Ф. Зебрафиш как модель в биомедицинских исследованиях. // Биомедицинская химия. – 2010. – Т. 56.- №.1. – С-120-131.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Shabanov P.D. Vliyaniye stressa novizny na povedencheskiye otvety Danio rerio i otsenka dozozavisimykh effektov anksiolitikov benzadiazepinovogo ryada na primere fenazepama [Effect of novelty stress on behavioral responses of Danio rerio and assessment of the dose-dependent effects of anxiolytics of benzadiazepine series using phenazepam as example] / Shabanov P.D., Lebedev V.A., Lebedev A.A. et al.// Obzory po klinicheskoy farmakologii i lekarstvennoy terapii [Reviews in clinical pharmacology and drug therapy]. – 2017. – V. 15. – No. 3. – P. 57-63. dol: 10.17816/RCF15357-63 [In Russian]
2. Kachanov D.A. Sravnitel'nyy analiz vliyaniya selektivnykh ingibitorov obratnogo zakhvata serotonina na povedeniye Danio rerio v usloviyakh eksperimental'noy depressii [Comparative analysis of effect of selective serotonin reuptake inhibitors on behavior of Danio rerio in experimental depression] // Mechnikov Readings-2018: materials of the All-Russian Scientific and Practical Student Conference with international participants. – St. Petersburg: Publishing House of the North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov. – 2018. – P. 636-637. [In Russian]
3. Silvia Ribeiro Toxicity screening of Diclofenac, Propranolol, Sertraline and Simvastatin using Danio rerioand Paracentrotus lividus embryo bioassays. / Silvia Ribeiro, Tiago Torres, Rosario Martins et al // Ecotoxicology and Environmental Safety. – 2015. – P. 67-74
4. Zolotarev K.V. Poisk markorov toksicheskogo deystviya CD2+ i Cu2+ metodom proteomnogo profilirovaniya pecheni i serdtsa Danio rerio [Search for markers of toxic effects of CD2 + and Cu2 + by proteomic profiling of the liver and heart Danio rerio] / Zolotarev K.V., Belyaeva N.F., Mikhailova M.V. et al. // Biotekhnologiya i meditsina [Biotechnology and medicine]. – 2015. [In Russian]
5. Skobkina M.N. Gormonal'naya induktsiya sozrevaniya i ovulyatsii in vitro ovotsitov Danio rerio (Danio rerio) i polucheniye yaytsekletok, sposobnykh k oplodotvoreniyu i razvitiyu. [Hormonal induction of in vitro maturation and ovulation of oocytes of Danio rerio and production of eggs capable of fertilization and development] / Skobkina M.N., Minin A.A.// Ontogenez [Ontogenesis]. – 2016. – V. 47. – No. 5. – P. 314-319 [In Russian]
6. Yang, T. Pharm Res / Yang, T., Martin, P., Fogarty, B. et al. (2015) 32: 2003. https://doi.org/10.1007/s11095-014-1593
7. Eric J. Mercero. The effect of cocaine on heart rate and electrocardiogram in Danio rerio. / Eric J. Mercero, Shelby L. Poitra, Ana Espinoza et al // Biochem Physiol С Toxicol Pharmacol. – 2015. – Р.1-6. - DOI: 10.1016 / j.cbpc.2015.03.007.
8. Blazhenko A.A. Doklinicheskoye issledovaniye nukleospermata natriya na modeli Danio rerio [Preclinical study of sodium nucleospermate in Danio rerio model] / Blazhenko A.A., Kachanov D.A., Proshin S.N. // [Mechnikov Readings-2018: materials of the All-Russian Scientific and Practical Student Conference with international participation. - St. Petersburg: Publishing House of the North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov]. – 2018. – P. 630-631. [In Russian]
9. Blazhenko A.A. Issledovaniye gormonopreparatov na modeli Danio rerio (Zebrafish). [Study of hormones on model of Danio rerio (Zebrafish). / Blazhenko A.A., Kachanov D.A., Proshin S.N. // [Mechnikov Readings-2018: materials of the All-Russian Scientific and Practical Student Conference with international participation. - St. Petersburg: Publishing House of the North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov]. – 2018. – P. 633-634. [In Russian]
10. Belyaeva N.F. Zebrafish kak model' v biomeditsinskikh issledovaniyakh [Zebrafish as model in biomedical research] / Belyaeva N.F. et al. // Biomeditsinskaya khimiya [Biomedical chemistry]. – 2010. – V. 56. – No. 1. – P.120-131. [In Russian]