MORPHOFUNCTIONAL FEATURES OF IMMUNOCOMPETENT HUMAN PLACENTA CELLS IN TYPE 1 DIABETES

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ 1 ТИПА

Научная статья

Дробинцева А.О.^1, *, Макаренко С.В², Медведев Д.С.³, Мальцев С.Б.⁴, Полякова В.О.⁵

¹ORCID 0000-0002-6833-6243;

⁵ORCID 0000-0001-8682-9909;

^{1, 2, 4, 5}Санкт-Петербургский медико-социальный институт, Санкт-Петербург, Россия;

^{1 ,2, 5}Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, Санкт-Петербург, Россия;

³СЗГМУ им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия

* Корреспондирующий автор (anna-flor[at]mail.ru)

Аннотация

Сахарный диабет 1 типа (СД1) является аутоиммунным заболеванием, а беременность при наличии СД1 сопряжена с рисками как для здоровья матери, так и для плода. Поскольку у женщин с СД1 может наблюдаться неблагоприятный исход беременности в связи с аберрантной иммунологической адаптацией к беременности, изучение иммунологических взаимодействий у беременных женщин с СД1 является одной из приоритетных задач.

В рамках данного исследования нами были изучены образцы, полученные от 80 пациентов: 40—от группы с СД1, 40—от группы контроля. Каждая из групп также была разделена на возрастные подгруппы, а также на подгруппы перво- и повторнородящих. В качестве молекул интереса нами были выбраны маркер макрофагов CD68, маркер В-лимфоцитов CD20, а также маркер NK-клеток CD57.

Наше исследование позволило выявить отличия в экспрессии маркеров иммунокомпетентных клеток между группой пациенток с СД1 и контрольной группой. Данные результаты говорят о высокой значимости исследованных маркеров для оценки течения беременности и состояния здоровья плода и матери.

Ключевые слова: беременность, сахарный диабет 1 типа, иммунокомпетентные клетки, плацента

MORPHOFUNCTIONAL FEATURES OF IMMUNOCOMPETENT HUMAN PLACENTA CELLS IN TYPE 1 DIABETES

Research article

Drobinceva A.O.^1, *, Makarenko S.V ², Medvedev D.S.³, Mal'cev S.B.⁴, Poljakova V.O.⁵

¹ORCID 0000-0002-6833-6243;

⁵ORCID 0000-0001-8682-9909;

^1,2,4,5 Saint-Petersburg Medico-Social Institute (SPbMSI), Saint Petersburg, Russia;

^1,2,5 St. Petersburg State Pediatric Medical University, Saint Petersburg, Russia;

³ North-western State Medical University named after I.I.Mechnikov, Saint Petersburg, Russia

* Corresponding author (anna-flor[at]mail.ru)

Abstract

Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is an autoimmune disease. Pregnancy in the presence of T1DM is associated with risks both for the health of a mother and a fetus. Since women with T1DM may experience an unfavorable outcome of pregnancy due to aberrant immunological adaptation to pregnancy, the study of immunological interactions in pregnant women with T1DM is one of the priority tasks.

Within this study, the authors have studied samples obtained from 80 patients: 40 — from the group with T1DM, 40 — from the control group. Each of the groups was also divided into age subgroups, as well as subgroups of primiparous and multiparous. The authors have selected the macrophage marker CD68, the marker of B-lymphocytes CD20, and the marker of NK cells CD57 as molecules of interest.

This study has revealed differences in the expression of markers of immunocompetent cells between the group of patients with type 1 diabetes and the control group. These results indicate the high significance of the studied markers for assessing the course of pregnancy and the health status of the fetus and mother.

Keywords: pregnancy, type 1 diabetes mellitus, immunocompetent cells, placenta

Введение

Плацента продуцирует ряд гормонов, влияющих на течение беременности, так, доказано, что наиболее активной тканью плаценты в метаболическом и функциональном плане является эпителий ворсинчатого хориона [5]. Однако многие вопросы, связанные с плацентарным барьером, в частности, вопросы иммунных взаимодействий на данный момент остаются не отвеченными.

В последние несколько десятилетий по всему миру фиксируется неуклонный рост количества пациентов с сахарным диабетом. По данным федерального регистра, на окончание 2018 года на диспансерном учёте в РФ стояло более 4.5 млн человек, что составляет более 3% населения. Из них более 256 тысяч — пациенты с сахарным диабетом 1 типа (СД1). Однако эксперты отмечают, что реальная численность пациентов с СД в РФ может быть не менее 9 млн человек (около 6% населения) [2].

Из данных литературы известно, что беременность при СД1 сопряжена с рисками преждевременных родов, преэклампсии, макросомии, внутриутробной гибели плода, пороков развития сердца и почек, однако контроль гликемии и прегравидарная подготовка снижают частоту гибели плода и пороков развития, наблюдаемых при таких беременностях [10].

 Эффективный контроль гликемии и артериального давления у матери позволяет снизить не только риск врождённых пороков развития и перинатальной смерти, но и риск развития осложнений у матери [6]. Кроме того, несмотря на тот факт, что ожирение в общем случае не является типичным для пациентов с СД1, тем не менее, оно становится всё более распространённым у пациентов с СД1 и связано с повышенным риском внутриутробной гибели плода, преэклампсии и перинатальной смертности и преждевременных родов [3, 4]. Следовательно, на стадии планирования беременности пациенткам с СД1 следует обращать особое внимание на массу тела.

Влияние беременности на материнскую систему обусловлено как гормональными, так и метаболическими факторами. Различные фазы протекания беременности являются про- и противовоспалительными [8]: так, фаза быстрого роста и развития плода является противовоспалительной, тогда как фазы имплантации и родов — провоспалительными. В настоящее время известно, что толерантность материнского организма к плоду вызвана модуляцией иммунной системы, а не её супрессией [9]. Поскольку у женщин с СД1 может наблюдаться неблагоприятный исход беременности в связи с аберрантной иммунологической адаптацией к беременности (изменение количества лейкоцитов, соотношения Th1/Th2, повышение экспрессии CD57 в NK-клетках, усиленная активация промежуточных и неклассических моноцитов) [7], изучение иммунологических взаимодействий у беременных женщин с СД1 является одной из приоритетных задач.

Целью нашего исследования являлся сравнительный анализ возрастных особенностей экспрессии маркеров иммунокомпетентных клеток плаценты человека при СД 1.

Материалы и методы

Сведения о пациентках

Объектом для морфофункционального исследования был выбран ворсинчатый хорион 80 плацент на 36-40 неделях гестации. Материал был получен в родильном отделении Научно-исследовательского института акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д. О. Отта у перво- и повторнородящих женщин различного возраста. В плаценте объектом для исследования были выбраны стволовые, промежуточные и терминальные ворсины.

Согласно предыдущим исследованиям, у беременных женщин старше 28 лет в большинстве случаев наблюдаются инволютивно-дистрофические изменения плаценты [1]. В связи с этим в текущем исследовании женщины были разделены на группы от 19 до 28 лет включительно и старше 28 лет до 40 лет включительно.

Гистологические и иммуногистохимические методы

Гистологические срезы готовили в соответствии со стандартным протоколом для тканей фиксированных в формалине и залитых в парафин.

Для иммуногистохимического окрашивания срезы помещали на предметные стекла, покрытые полилизином. Использовали первичные моноклональные антитела к CD57 (1:50, Novocastra), CD20 (1:100, Dako) и CD68 (1:50, Novocastra). Использовали универсальный набор, содержащий биотинилированные вторичные антитела (ABC-kit, Novocastra). Морфометрический анализ проводился с использованием программного обеспечения «ВидеоТест Морфология 5.0». В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 400.

В качестве оценочных параметров были взяты относительная площадь экспрессии (ОПЭ). Этот параметры отражают интенсивность синтеза или накопление сигнальных молекул. Статистическая обработка всех экспериментальных данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась с помощью программы Statistica 6.0. Для попарного сравнения групп использовался критерий Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

Исследования позволили оценить различия экспрессии различных маркеров в ворсинах хориона в разных возрастных группах.

Верификация экспрессии маркера макрофагов в плаценте у женщин разных возрастных групп

Проведенные нами исследования позволили оценить различия экспрессии протеина CD68 в ворсинах хориона в разных возрастных группах: в группе первородящих женщин старшего возраста с СД1 экспрессия CD68 была статистически более выраженной, чем в контрольной группе. При морфометрическом анализе микроскопических изображений были выявлены значимые различия между экспрессии маркера макрофагов в зависимости от возраста. В контроле у первородящих женщин наблюдалось достоверное увеличение экспрессии маркера макрофагов в старшем возрасте по сравнению с младшим в 1,5 раза по показателю ОПЭ. Аналогичная тенденция наблюдалась в группе женщин с CД1, где среднее значение у женщин младше 28 лет составило 1,55±0,40%, а у женщин старше 28 лет — 2,53±0,39%. Данные по экспрессии маркеров макрофагов, а также В-лимфоцитов и натуральных киллеров представлены в табл. 1

Таблица 1 – Данные по относительной площади экспрессии (ОПЭ) маркеров иммунокомпетентных клеток

		CD68	CD20	CD57
Контрольная группа	Первородящие ≤28	1,34±0,21	0,22±0,02	0,16±0,02
	Первородящие >28	1,96±0,25*	0,2±0,02	0,23±0,02
	Повторнородящие ≤28	1,52±0,27	0,13±0,03	0,15±0,03
	Повторнородящие >28	1,24±0,32	0,22±0,04*	0,21±0,04
СД1 типа	Первородящие ≤28	1,55±0,40	0,52±0,04	0,23±0,02
	Первородящие >28	2,53±0,39*	0,32±0,03	0,22±0,03
	Повторнородящие ≤28	2,42±0,29	0,42±0,02	0,31±0,04
	Повторнородящие >28	3,20±0,40*	0,42±0,04	0,21±0,02*

Примечание: * - статистически достоверное отличие показателя в группе старшего репродуктивного возраста (>28 лет) от показателя в группе младшего репродуктивного возраста (≤28 лет) (p<0,05)

В контрольной группе, а также в группе с СД1 наблюдалось усиление экспрессии маркера макрофагов в старшей возрастной группе, что, по-видимому, связано с функциями выполняемыми макрофагами в плаценте. Известно, что с возрастом частота воспалительных заболеваний возрастает, это утверждение также справедливо и для женщин с сахарным диабетом.

При исследовании плацент повторнородящих женщин, показатели экспрессии в плацентах у женщин с СД1 младшего возраста были меньше по сравнению со старшей возрастной группой. Сравнение средних значений ОПЭ у повторнородящих женщин выявило следующие различия: в группе с СД1 старше 28 лет экспрессия маркера макрофагов в ворсинах хориона была достоверно выше по сравнению с экспрессией его в плацентах из младшей возрастной группы (2,42±0,29 и 3,20±0,40, соответственно).

У повторнородящих женщин в контроле не было различий между старшей и младшей возрастной группой по показателю ОПЭ маркера макрофагов; наблюдалась легкая тенденция к снижению в старшей возрастной группе, что подтверждает теорию о снижении иммунной функции с возрастом. В то же время в группе с СД1 наблюдалось статистически значимое увеличение экспрессии маркера макрофагов, это явление может быть обусловлено, как общей реакцией организма на хроническое воспаление, так и наличием гестоза именно в этой группе женщин, где средняя и тяжелая степень гестоза наблюдалась в самом большом числе случаев.

Верификация экспрессии маркера В-лимфоцитов в плаценте у женщин разных возрастных групп

Возрастных изменений экспрессии протеина CD20 по показателю ОПЭ в группе с СД1 и контрольной группе нами не зарегистрировано. Однако нами было установлено, что в группе с СД1 В-лимфоциты в плаценте встречались чаще, чем у в контрольной группе. Это может быть связано с тем, что у женщин с СД частота урогенитальных заболеваний намного выше, чем у здоровых женщин.

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что в группе с СД1 не только было зарегистрировано большее количество В-лимфоцитов, но они также имели большее число рецепторов, способствующих активации. Возможно, это связано с присутствующим инфекционным процессом, или с необходимостью большего числа рецепторов для активации, так как повышенное содержание сахара в крови подавляет функцию иммунной системы.

У повторнородящих женщин только в группе контроля было отмечено увеличение экспрессии маркера CD20 в старшей возрастной группе, тогда как в группе с СД1 не было изменения экспрессии маркера В-лимфоцитов с возрастом.

Верификация экспрессии маркера NK-клеток в плаценте у женщин разных возрастных групп

Экспрессия маркера NK-клеток в ворсинах хориона была слабой во всех исследуемых группах. Однако из полученных данных можно сделать вывод, что натуральные киллеры присутствуют в плацентах женщин с сахарным диабетом в большем количестве, чем в контрольной группе. Несмотря на это, значимых различий в экспрессии CD57 в разных возрастных группах у первородящих женщин по показателю ОПЭ выявлено не было.

В подгруппах повторнородящих женщин было обнаружено снижение относительной площади экспрессии CD57 в подгруппе старшего репродуктивного возраста по сравнению с младшей у пациентов с СД1. По оптической плотности значимых отличий обнаружено не было.

Заключение

Текущее исследование позволило выявить отличия в экспрессии маркеров иммунокомпетентных клеток между группой пациенток с СД1 и контрольной группой. Сигнальные молекулы и цитокины, продуцируемые иммунными клетками, играют ключевую роль в развитии патологических состояний, возникающих во время беременности. Результаты текущего исследования говорят о высокой эпидемиологической и научно-исследовательской значимости маркеров воспаления для оценки течения беременности и возможного развития соматической патологии у новорожденных детей, особенно у рожениц старшего возраста.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

 

Список литературы / References

1. Айламазян Э.К.Акушерство. Учебник для медицинских вузов / Э. К. Айламазян – СПб: СпецЛит, 2003. Вып. 4, доп.– 523c.
2. Дедов И.И.Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом / И. И. Дедов, М. В. Шестакова, А. Ю. Майоров – Москва, 2019. Вып. 9.
3. Chung J.H. Increasing pre-pregnancy body mass index is predictive of a progressive escalation in adverse pregnancy outcomes / J. H. Chung, K. A. Melsop, W. M. Gilbert, A. B. Caughey, C. K. Walker, E. K. Main // J. Matern. Neonatal Med. – 2012. – Т. 25 – № 9 – 1635–1639с.
4. Cnattingius S. Prepregnancy Weight and the Risk of Adverse Pregnancy Outcomes / S. Cnattingius, R. Bergström, L. Lipworth, M. S. Kramer // N. Engl. J. Med. – 1998. – Т. 338 – № 3 – 147–152с.
5. Drobintseva A.O., Andreev A.E., Makarenko S.V., Medvedev D.S., Soldatova Y.A., Polyakova V.O. Influence of endocrine pathology on neuroimmouns interactions in placenta. Медицинский академический журнал. 2019. Т. 19. № S. С. 72-74.
6. Feldman A.Z. Management of Type 1 Diabetes in Pregnancy. / A. Z. Feldman, F. M. Brown // Curr. Diab. Rep. – 2016. – Т. 16 – № 8 – 76с.
7. Groen B. Immunological Adaptations to Pregnancy in Women with Type 1 Diabetes. / B. Groen, A.-E. van der Wijk, P. P. van den Berg, J. D. Lefrandt, G. van den Berg, K. M. Sollie, P. de Vos, T. P. Links, M. M. Faas // Sci. Rep. – 2015. – Т. 5 – 13618с.
8. Mor G. The immune system in pregnancy: a unique complexity. / G. Mor, I. Cardenas // Am. J. Reprod. Immunol. – 2010. – Т. 63 – № 6 – 425–33с.
9. Tabarkiewicz J. Autoimmunity in Reproductive Health and Pregnancy. / J. Tabarkiewicz, S. R. Selvan, N. Cools // J. Immunol. Res. – 2018. – Т. 2018 – 9501865с.
10. Vargas R. Type 1 diabetes mellitus and pregnancy. / R. Vargas, J. T. Repke, S. H. Ural // Rev. Obstet. Gynecol. – 2010. – Т. 3 – № 3 – 92–100с.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Haylamazyan E.K. Uchebnik dlya meditsinskikh vuzov [Obstetrics. Textbook for medical schools] / E.K. Aylamazyan – St. Petersburg: SpecLit, 2003. Issue. 4, add. – 523 p. [In Russian]
2. Dedov I.I. Algoritmy spetsializirovannoy meditsinskoy pomoshchi bol'nym sakharnym diabetom [Algorithms for specialized medical care for patients with diabetes mellitus] / I. I. Dedov, M. V. Shestakova, A. Yu. Mayorov – Moscow, 2019. 9. [In Russian]
3. Chung J.H. Increasing pre-pregnancy body mass index is predictive of a progressive escalation in adverse pregnancy outcomes / J. H. Chung, K. A. Melsop, W. M. Gilbert, A. B. Caughey, C. K. Walker, E. K. Main // J. Matern. Neonatal Med. – 2012. – Vol. 25 – № 9 – P. 1635–1639.
4. Cnattingius S. Prepregnancy Weight and the Risk of Adverse Pregnancy Outcomes / S. Cnattingius, R. Bergström, L. Lipworth, M. S. Kramer // N. Engl. J. Med. – 1998. – Vol. 338 – № 3 – P. 147–152.
5. Drobintseva A.O., Andreev A.E., Makarenko S.V., Medvedev D.S., Soldatova Y.A., Polyakova V.O. Influence of endocrine pathology on neuroimmouns interactions in placenta. Медицинский академический журнал. 2019. Vol. 19. № S. P. 72-74.
6. Feldman A.Z. Management of Type 1 Diabetes in Pregnancy. / A. Z. Feldman, F. M. Brown // Curr. Diab. Rep. – 2016. – Vol. 16 – № 8 – 76 p.
7. Groen B. Immunological Adaptations to Pregnancy in Women with Type 1 Diabetes. / B. Groen, A.-E. van der Wijk, P. P. van den Berg, J. D. Lefrandt, G. van den Berg, K. M. Sollie, P. de Vos, T. P. Links, M. M. Faas // Sci. Rep. – 2015. – Vol. 5 – 13618 p.
8. Mor G. The immune system in pregnancy: a unique complexity. / G. Mor, I. Cardenas // Am. J. Reprod. Immunol. – 2010. – Vol. 63 – № 6 – P. 425–33.
9. Tabarkiewicz J. Autoimmunity in Reproductive Health and Pregnancy. / J. Tabarkiewicz, S. R. Selvan, N. Cools // J. Immunol. Res. – 2018. – Vol. 2018 – P. 9501865.
10. Vargas R. Type 1 diabetes mellitus and pregnancy. / R. Vargas, J. T. Repke, S. H. Ural // Rev. Obstet. Gynecol. – 2010. – Vol.. 3 – № 3 – P. 92–100.