The prognostic significance of gene expression regulating the haemostatic system in myocardial infarction
The prognostic significance of gene expression regulating the haemostatic system in myocardial infarction
Abstract
Currently, the expression of candidate genes encoding proteins that activate the haemostatic system is viewed as an additional prognostic parameter for determining an ‘adverse outcome’ in cardiovascular accidents.
Objective. To assess the expression levels of genes associated with haemostatic disorders in order to determine the likelihood of re-hospitalisation, one-year patient survival, and the prognosis for an unfavourable course of CHD.
Materials and methods. This study included 61 patients with acute myocardial infarction with ST-segment elevation (STEMI) and without ST-segment elevation (NSTEMI). The control group consisted of patients with no history of coronary heart disease. All study participants underwent evaluation of the relative expression levels of four genes: SERPINE/PAI-1, FGB, ITGA2 and ITGB3, which are most strongly associated with haemostatic disorders in patients with cardiovascular patholody.
Research results. In the main group, a statistically significant increase in the RQ of the SERPINE/PAI-1 and ITGB3 genes was observed compared with the control group. The study showed that gene activity was significantly higher in patients under 60 years of age with reduced cardiac contractility, and with moderately reduced and reduced left ventricular contractility. Furthermore, the prognosis for recurrent cardiovascular events within one year of hospitalisation was evaluated in groups of patients with favourable and unfavourable clinical outcomes.
Conclusion. Thus, the expression of the SERPINE/PAI-1 and ITGB3 genes may serve as an additional prognostic marker for the severity of cardiovascular accidents.
1. Введение
За последние 10 лет более половины смертей в нашей стране произошла по причине сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Причем их большая часть связана с острыми и хроническими формами ишемической болезни сердца (ИБС) . Среди них есть пациенты очень высокого риска, в том числе, с рецидивирующим течением ССЗ, что заставляет вести поиск новых предикторов, обладающих особой прогностической ценностью. В настоящее время значительное внимание уделяется изучению воздействия активности различных генов-кандидатов, контролирующих систему гемостаза, при данных патологических состояниях .
В современной литературе появляется все больше данных о тесной связи SERPINE-1/PAI-1 (гена, кодирующего ингибитор активатора плазминогена – 1), FGB (гена, кодирующего бета-полипептидную цепь белка фибриногена), ITGA2 (гена, кодирующего белок интегрин альфа-2) и ITGB3 (гена, кодирующего белок интегрин бета-3) с тяжестью течения и развитием ССС , .
Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилась оценка уровня экспрессии генов, связанных с нарушением гемостаза, для определения вероятности повторной госпитализации, годовой выживаемости пациентов и прогноза «неблагоприятного» течения ИБС.
2. Методы и принципы исследования
В настоящем исследовании приняли участие 61 пациент с острым инфарктом миокарда 65,50 ± 16,50 года (от 43 до 82 лет). Группа контроля была представлена пациентами без ССЗ (n=18). В анамнезе у пациентов группы контроля не отмечено ишемической болезни сердца, клапанных пороков и артериальной гипертензии. Все пациенты из группы контроля имели низкий сердечно-сосудистый риск (в среднем ЛПНП было менее 3 ммоль/л). Возраст пациентов группы контроля 38,00±8,00 (от 30 до 46 лет). Всем пациентам была проведена оценка относительного уровня экспрессии генов, контролирующих систему гемостаза: SERPINE/PAI-1, FGB, ITGA2 и ITGB3. При этом экспрессия генов в группе контроля была принята за единицу. Согласно полученным результатам относительно экспрессии целевых генов, все пациенты с сердечно-сосудистыми событиями (ССС) были разделены на две группы.
1 — с неблагоприятным течением инфаркта миокарда (ИМ) (n=38);
2 — с благоприятным течением (n=23).
Критерии неблагоприятного течения инфаркта миокарда были определены на основе априорного отбора клинических и лабораторно-инструментальных факторов, доказавших свою прогностическую значимость в крупных многоцентровых исследованиях и систематических обзорах. В окончательную модель были включены следующие показатели: возраст старше 60 лет, наличие хронической болезни почек (ХБП) со скоростью клубочковой фильтрации (СКФ)<60 мл/мин/1,73 м2, фракция выброса (ФВ) левого желудочка (ЛЖ)<49%, артериальное давление (АД)<90/60 мм рт ст (нестабильная гемодинамика), частота сердечных сокращений (ЧСС)>90 уд/мин на момент поступления, дислипидемия, стентированные коронарные артерии (КА) и уровень экспрессии исследуемых генов. Проведён регрессионный анализ для валидации критериев, ассоциированных с неблагоприятным течением сердечно-сосудистого события. Анализ экспрессии генов проводили методом ПЦР в реальном времени на приборе CFX96 (Bio-Rad, США) на основе TaqMan-технологии с использованием коммерческих наборов (Applied BioSystems, США) смеси праймеров (короткая олиго- или полинуклеотидная последовательность со свободной З’ОН-группой, комплементарно связанная с однонитевой ДНК или РНК; с его 3’-конца ДНК-полимераза начинает наращивать полидезоксирибонуклеотидную цепь) и зондов (короткий отрезок ДНК или РНК известной структуры или функции, меченный каким-либо радиоактивным или флуоресцентным соединением). При оценке относительного уровня экспрессии генов (RQ) использовался метод 2–ΔΔCT, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия целевых генов у исследуемых групп по сравнению с группой контроля. Определение уровня экспрессии целевых генов проводили относительно референсного гена бета актина (ACTB). ΔΔCt — количество циклов, которое необходимо для пороговой экспрессии генов (RQ). ΔΔCt рассчитывали как ΔΔCt = ΔCt (исследуемой группы) — ΔCt (группы контроля). Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 4.8.0 (разработчик — ООО «Статтех», Россия). Для статистического анализа был использован непараметрический метод — U-критерий Манна-Уитни. Статистическая значимость определялась при уровне p<0,01. Для факторов с тремя категориями количество пораженных артерий и стентированные коронарные артерии применена поправка Бонферрони. Для анализа качественных признаков применялся критерий χ2 с уровнем значимости p<0,05. Прогностическая модель, описывающая зависимость количественной переменной от факторов, разрабатывалась с использованием метода логистической регрессии.
3. Основные результаты
Средний возраст пациентов с ССС составил 65,50 лет (± 16,50), среди них 23,12% женщин и 76,88% мужчин. На момент поступления 24,91% пациентов имели АД в целевом диапазоне, тогда как 26,72% столкнулись с нестабильной гемодинамикой. Около половины пациентов показали сниженные или умеренно сниженные показатели ФВ ЛЖ (n=29, среднее значение ФВ=43,31%, медиана соответствует 44,50%). Лишь 7,69% (среднее значение ЛПНП 1,13 ммоль/л, медиана 1,14 ммоль/л) пациентов достигли целевого уровня холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП), в то время как остальные имели более высокие показатели. Более половины пациентов страдали от поражения нескольких КА. В 41% случаев инфаркт-зависимой КА была передняя межжелудочковая ветвь (ПМЖВ).
Анализ RQ исследуемых генов показал, что в группе пациентов с ССС наблюдается статистически значимое увеличение экспрессии генов PAI-1 и ITGB3 по сравнению с контрольной группой (p<0,01). При этом количество циклов ΔΔCt, необходимое для достижения порогового уровня экспрессии этих генов, было значительно меньше, чем для генов FGB и ITGA2 (табл. №1).
Уровень экспрессии генов, контролирующих гемостаз, у пациентов с кардиоваскулярными заболеваниями
RQ – уровень экспрессии гена, относительно группы сравнения, принятой за 1; ΔΔCt – количество циклов достижения пороговой экспрессии гена; * – статистически значимая разница относительно группы сравнения, принятой за 1, p<0,05; ** – статистически значимая разница относительно группы сравнения, p≤0,01
| PAI-1 | FGB | ITGA2 | ITGB3 |
RQ ДИ 95% [25;75] | 3,35 [2,81; 4,00] * | 0,01 [-0,36; 0,33] | 0,68 [0,55; 0,87] | 5,02 [2,98; 7,56] ** |
ΔΔCt Ме [Q1-Q3] | 8,45 [6,56-11,77] ** | 8,73 [7,40-10,86] | 2,21 [0,30-4,44] | 0,76 [-1,72-4,54] ** |
p | p≤0,01 | p=0,05 | p=0,05 | p≤0,01 |
На следующем этапе исследования был проведен сравнительный анализ активности упомянутых генов с учетом возраста пациентов, величины ФВ ЛЖ, объема поражения коронарного русла и вида стентирования КА. Пациенты с ССС были разделены на две группы по возрастному критерию: младше 60 лет и старше 60 лет. У пациентов старше 60 лет чаще осуществлялось стентирование ПМЖВ левой коронарной артерии (ЛКА). В группе пациентов младше 60 лет была выявлена гиперэкспрессия гена PAI-1 (7,34; p ≤ 0,05). В зависимости от уровня ФВ ЛЖ пациенты были разделены на две подгруппы: с ФВ<49% и > 50%. У пациентов с ФВ ЛЖ <49% наблюдалось статистически значимое увеличение экспрессии гена ITGB3 (5,84; p ≤ 0,05). В соответствии с клинической характеристикой, поражение трех и более КА преимущественно регистрировалось у мужчин. У них чаще проводилоcь стентирование ПМЖВ ЛКА, в то время как при однососудистом и двусосудистом поражении стентированию подвергалась, в основном, огибающая ветвь (ОВ) ЛКА. Достоверная гиперэкспрессия ITGB3 наблюдалась у пациентов со стентированием ПМЖВ (5,39; p ≤ 0,05) и ОВ ЛКА (5,17; p ≤ 0,05). В то же время уровень экспрессии SERPINE/PAI-1 был значительно выше у пациентов со стентированной правой коронарной артерией (ПКА) (8,86; p ≤ 0,05) (табл. 2). Для факторов с тремя категориями (количество пораженных коронарных артерий, стентированные коронарные артерии) применена поправка Бонферрони. Исходное различие по объему поражения коронарного русла не является статистически устойчивым (p=0,15), в связи с чем данные по объему поражения коронарного русла не включены в таблицу ниже.
Уровень экспрессии генов в зависимости от возраста, фракции выброса ЛЖ и вида стентированой КА
* – статистически значимая разница относительно группы сравнения, принятой за 1, p<0,05; ** – статистически значимая разница относительно группы сравнения, p≤0,01;
RQ – уровень экспрессии гена, относительно группы сравнения, принятой за 1; ΔΔCt – количество циклов достижения пороговой экспрессии гена;
1 – ЧТКАС ПМЖВ; 2 – ЧТКАС ОВ; 3 – ЧТКАС ПКА
Показатель | Способ группировки | p | ||||
Возраст | < 60 лет (n=21) | > 60 лет (n=40) |
| |||
| PAI-1 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 7,34 [6,38;9,96] * | 1,41 [0,58;1,53] | p≤0,05 | |||
ΔΔCt Ме [Q1-Q3] | -2,86** [–5,72; 1,08]** | -0,48 [–0,60; 1,09] | p≤0,01 | |||
| ITGB3 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 3,41 [0,82;11,60] | 1,61 [0,84;10,60] | p=0,11 | |||
ΔΔCt Ме [Q1-Q3] | -1,76 [–9,14; –1,15] | -0,68 [–2,04; 5,03] | p=0,05 | |||
Фракция выброса левого желудочка | ФВ ЛЖ<49% (n=29) | ФВ ЛЖ>50% (n=32) |
| |||
| PAI-1 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 3,88 [0,67; 9,13] | 2,88 [0,57; 11,92] | p=0,37 | |||
ΔΔCt Ме [Q1-Q3] | -1,95 [–3,82; 1,08] | -1,527 [–2,72; 1,27] | p=0,05 | |||
| ITGB3 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 5,84 [0,09;11,32] * | 0,74 [0,72;1,05] | p ≤ 0,05 | |||
ΔΔCt Ме [Q1-Q3] | -2,54** [–4,25; 0,35]** | 0,42 [–2,92; 7,40] | p≤0,01 | |||
Стентированные КА | 1.ЧТКАСПМЖВ n=24 | 2. ЧТКАС ОВ n=15 | 3. ЧТКАС ПКА n=22 |
| ||
| PAI-1 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 2,55 [0,61; 9,56] | 2,97 [0,65; 8,74] | 8,86*[4,42; 15,84] | p 1,2 = 0,05 p 2,3 ≤ 0,05 p 1,3 ≤ 0,05 | ||
ΔΔCt Ме[Q1-Q3] | -1,34 [-2,59; 1,32] | -1,57 [-4,06; 1,13] | -3,14**[–5,32; 14,58] | p 1,2 = 0,05 p 2,3 ≤ 0,01 p1,3 ≤ 0,01 | ||
| ITGB3 |
| ||||
RQ % ДИ 95% [25;75] | 5,39 [0,83;12,38] | 5,17 [0,84;12,26] | 0,33 [0,06;1,07] | p 1,2 = 0,05 p 2,3 ≤ 0,05 p 1,3 ≤ 0,05 | ||
ΔΔCt Ме[Q1-Q3]
| -2,43 [–4,39; 4,12] | –2,37 [–9,14; 4,13] | 1,59[–1,68; 9,46] | p 1,2 = 0,05 p 2,3 ≤ 0,01 p 1,3 ≤ 0,01 | ||
С целью оценки прогностической значимости экспрессии гена PAI-1 в отношении возрастных характеристик (в отношении пациентов < 60 лет) был проведен ROC-анализ, позволяющий определить дискриминационную способность показателя и установить его оптимальное пороговое значение. По результатам анализа установлено, это экспрессия гена PAI-1 является статистически значимым предиктором возраста < 60 лет (AUC=0,75), что соответствует удовлетворительному качеству модели. Чувствительность модели при данном пороге составила 76,90%, специфичность - 62,50%, что свидетельствует о её умеренной диагностической эффективности (рис. 1).
ROC-кривая для PAI-1: предсказание возрастной группы младше 60 лет
ROC-кривая для ITGB3: предсказание низкой и умеренно сниженной ФВ
ФВ ≤ 40%
Модель продемонстрировала высокую прогностическую способность:
Коэффициент множественной корреляции составил rxy = 0,85, что соответствует очень высокой тесноте связи по шкале Чеддока.
Модель в целом была статистически значима (p = 0,006).
Коэффициент детерминации R² = 0,72, что означает, что модель объясняет 72,4% общей вариабельности исхода.
Анализ исхода в зависимости от возраста, ЧСС, уровня АД, креатинина крови, фракции выброса, уровня ЛПНП, RQ PAI-1, RQ ITGB3, объема поражения коронарного русла
* – различия показателей статистически значимы (p < 0,05)
| B | Стд. ошибка | t | p |
Intercept | -1,08 | 0,87 | -1,24 | 0,23 |
Возраст | 0,000 | 0,01 | 0,04 | 0,97 |
ЧСС на момент поступления | 0,01 | 0,00 | 1,50 | 0,15 |
САД менее 90/60 м рт.ст. на момент поступления | -0,01 | 0,01 | -0,90 | 0,38 |
Креатинин на момент поступления | 0,00 | 0,00 | 0,08 | 0,94 |
Фракция выброса | 0,00 | 0,01 | 0,10 | 0,92 |
Уровень ЛПНП | -0,07 | 0,10 | -0,69 | 0,50 |
RQ PAI-1! | 0,00 | 0,00 | 0,64 | 0,54 |
RQ ITGB3 | 0,01 | 0,01 | 2,22 | 0,04* |
Syntax score! | 0,02 | 0,01 | 2,17 | 0,04* |
Далее была проведена оценка повторных госпитализаций. Причем наблюдение проводилось в течение года, после перенесенного ССС. Оценивалась госпитализация, в ходе которой проведена коронароангиогрфия без/с стентированием, госпитализация по другим ССЗ, а также заболеваниям других органов и систем. В группе с неблагоприятным течением мы наблюдали 42,86% (18 из 38) повторных госпитализаций, среди них все пациенты были госпитализированы по заболеванию сердечно-сосудистой системы. 31,05% пациентов госпитализировались с клиникой острого коронарного синдрома, из них у 14,13% был подтвержден диагноз повторного острого ИМ, у 16,92% — нестабильная стенокардия. 22,30% проведено повторное стентирование инфаркт/ишемия-связанной коронарной артерии. 11,69% пациентов госпитализированы по причине пароксизмальной фибрилляции предсердий, с клиникой декомпенсации хронической сердечной недостаточности и гипертонического криза, осложненного острой левожелудочковой недостаточностью и гипертонической энцефалопатией, то есть по причине других ССЗ. У пациентов из группы благоприятного течения результаты имели положительный прогностический характер. 16,15% (4 из 23) повторно госпитализировались в течение года после перенесенной сердечно-сосудистой катастрофы. Различия статистически значимы: χ² = 4,36 (с поправкой Йейтса), p=0,03. Отношение шансов (OR) составило 4,28 (95% ДИ: 1,22-14,97), что указывает на более чем четырёхкратное повышение риска повторной госпитализации при неблагоприятном течении. Из них 9,42% пациента с клиникой острого коронарного синдрома, при этом диагноз острого инфаркта подтвердился только у 3,00% пациентов. 6,58% пациентам проведено стентирование КА. 6,75% пациентов проходили стационарное лечение с фибрилляцией предсердий, клиникой острой левожелудочковой недостаточности на фоне гипертонического криза. 1,63% пациентов повторно госпитализировались ввиду недифференцированного артрита и цирроза печени.
4. Обсуждение
Состояние системы гемостаза у пациентов с очень высоким и экстремальным сердечно-сосудистым риском остается в фокусе современных исследований. Ключевым патогенетическим звеном сердечно-сосудистых событий является атеротромбоз, что обусловливает потребность в новых, более информативных маркерах его развития. Рутинные лабораторные тесты (уровень фибриногена, ПТИ, МНО, стандартная коагулограмма) не всегда отражают комплексные нарушения гемостаза в данной популяции. В этой связи оценка генетических детерминант, регулирующих процессы тромбообразования в коронарном русле, представляется перспективным направлением . В данном исследовании была оценена экспрессия генов SERPINE/PAI-1, FGB, ITGA2 и ITGB3, которые, согласно данным мировой статистики, наиболее ассоциированы с нарушением гемостаза у пациентов с сердечно-сосудистой патологией. Особое внимание уделялось роли этих генетических факторов в развитии острого коронарного синдрома (ОКС) у пациентов молодого возраста (до 60 лет). В исследовании Sheikhvatan et al. (2019) подчеркивается роль ITGB3 как основного интегрина, ответственного за миграцию гладкомышечных клеток, что может быть ключевым фактором в развитии диффузного поражения коронарных артерий . Ассоциация полиморфизмов ITGB3 с исходами чрескожных коронарных вмешательств подтверждена, в частности, в популяции Бангладеш (Islam et al., 2021) . Среди отечественных исследований стоит обратить внимание на работу Муслимовой Э.Ф., где носительство аллеля 1565C гена ITGB3 сопряжено с риском ИБС . Полиморфизм гена ITGB3, в частности вариант PIA2, ассоциирован с повышенным риском инфаркта миокарда, а также с неблагоприятными исходами после коронарного вмешательств, включая рестеноз и тромботические осложнения . Причем генетические варианты ITGB3 могут быть связаны с ранним развитием атеротромботических событий и худшим ответом на лечение . В нашей работе значение ITGB3 оказалось статистически значимым в группе пациентов очень высокого риска, страдающих от коронарного поражения и перенесших острый инфаркт миокарда. Активность этого гена была тесно связана с фракцией выброса левого желудочка и стентированием ветвей левой коронарной артерии.
Одной из задач нашего исследования было выявление генетических факторов, которые могут способствовать развитию острого коронарного синдрома (ОКС) у пациентов в возрасте до 60 лет. Результаты показали гиперэкспрессию PAI-1 в этой группе, что соответствует данным исследования Hamsten A et al. (1985), где избыток PAI-1 был отмечен у молодых мужчин и женщин, перенесших острый инфаркт миокарда . Подобное исследование было проведено среди молодого индейского населения, однако, была оценена роль полиморфизма 4G/5G гена PAI-1 c развитием ишемического инсульта . Эти данные согласуются с результатами недавнего исследования группы американских ученых, в котором также определена связь полиморфизма гена PAI-1 с развитием инфаркта миокарда у пациентов молодого возраста, что подчеркивает значимость данного фактора в раннем развитии острого коронарного синдрома . Современные исследования подтверждают значимую роль PAI-1 в формировании неблагоприятных исходов после чрескожных коронарных вмешательств. В частности, показано, что повышенный уровень PAI-1 ассоциирован с развитием рестеноза в зоне имплантации коронарного стента .
Эти результаты подчеркивают важность генетических факторов в патогенезе острых коронарных событий и могут служить основой для дальнейших исследований в направлении клинической практики с целью улучшения диагностики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.
Ограничением исследования можно считать относительно небольшой размер выборки, что могло повлиять на статистическую значимость некоторых показателей. Полученные данные открывают перспективы для клинического внедрения молекулярно-генетических маркеров. Повышенная экспрессия генов ITGB3 и *SERPINE1 (PAI-1)* может быть использована для дополнительной стратификации риска неблагоприятных исходов у пациентов с очень высоким и экстремальным сердечно-сосудистым риском. Разработанная регрессионная модель, объясняющая 72,4% вариабельности исхода, потенциально применима для персонализации прогноза и выбора тактики реваскуляризации. В частности, гиперэкспрессия *PAI-1* у пациентов моложе 60 лет позволяет идентифицировать подгруппу с агрессивным течением атеротромбоза. Внедрение количественной ПЦР-оценки экспрессии данных генов в клиническую практику может повысить точность прогнозирования и обосновать дифференцированную антитромботическую терапию.
5. Заключение
В итоге проведенного исследования было обнаружено значительное повышение уровня относительной экспрессии генов ITGB3 и SERPINE/PAI-1 у пациентов с сердечно-сосудистыми событиями. Пациенты из группа неблагоприятного течения гораздо чаще госпитализировались, особенно с клиникой повторного острого коронарного синдрома, им статистически значимо чаще проводилось стентирование коронарных артерий. Это выраженное увеличение активности генов может указывать на более агрессивное течение заболевания и на его степень тяжести, что подтвердилось результатами наблюдения за пациентами из группы исследования.