Blue-emissing fluorophore from the basidiomycete Neonothopanus nambi

Несмотря на внушительный список имеющихся в настоящее время синтетических флуоресцентных красителей, поиск новых природных низкомолекулярных флуорофоров, по-прежнему, является актуальным

В недавних исследованиях мы выделяли экстраклеточные ферменты из светящегося базидиомицета N. nambi оригинальным способом обработки его мицелия β-глюкозидазой

Целью данной работы было: оценить квантовый выход флуоресценции обнаруженного флуорофора из N. nambi в водной среде; изучить возможность связывания данного флуорофора с некоторыми объектами биологической и небиологической природы; оценить интенсивность световой эмиссии этих объектов с адсорбированным флуорофором.

В исследованиях использовали водные экстракты из светящегося базидиомицета N. nambi IBSO 2391 (Коллекция микроорганизмов CCIBSO 836 Института биофизики ФИЦ КНЦ СО РАН, Красноярск), содержащие флуоресцирующий в синей области спектра внеклеточный грибной компонент. Для экспериментов в качестве модельных адсорбентов биологической природы с разным уровнем структурно-морфологической организации использовали бычий сывороточный альбумин — БСА (Serva, Германия) и клетки пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae марки Саф-Момент (САФ-Нева, Россия). В качестве модельных адсорбентов небиологической природы были использованы диэтиламиноэтил-(DEAE)-целлюлоза (Serva, Германия), диэтил-(2-гидрокси-пропил)-аминоэтил-(QAE)-сефадекс (Pharmacia, Швеция) и оксигидроксид алюминия (бёмит — γ-AlO(OH)) (производитель — Korea Atomic Energy Research Institute, Республика Корея). Выбор DEAE-целлюлозы и QAE-сефадекса был вызван их широким применением в качестве эффективных сорбентов для ионообменной хроматографии

Изучение спектральных и флуоресцентных свойств водных образцов, содержащих изучаемый флуорофор, проводили на спектрофотометре UV-1800 (Shimadzu, Япония) и спектрофлуориметре Varian Cary Eclipse (Agilent Technologies, США).

Во всех экспериментах использовали водный раствор флуорофора с одинаковой оптической плотностью. Все измерения проводили в трех повторностях.

Квантовый выход (QY) изучаемого флуоресцирующего компонента из базидиомицета N. nambi оценивали с помощью относительного сравнительного метода

(1)

где n — показатель преломления растворителя, S — наклон графика зависимости интегральной интенсивности флуоресценции против поглощения, индексы s и r обозначают исследуемый образец (sample) и эталон (reference) соответственно.

Адсорбцию флуорофора на молекулы модельного белка (БСА) проводили следующим образом. К 1 мл водного раствора флуорофора добавляли 200 мкл водного раствора БСА с концентрацией 10 мг/мл, приготовленного в деионизированной (ДИ) воде (Milli-Q system, Millipore, США), после чего образец перемешивали и инкубировали 20 мин при температуре 22°С. Затем белковые молекулы с адсорбированным флуорофором осаждали добавлением в образец сульфата аммония до 60-80% насыщения и собирали образующийся белковый преципитат центрифугированием при 16000 g (Centrifuge 5415R, Eppendorf, Германия) в течение 5 мин при 4°С. Супернатант отбирали для оценки количества не связавшегося с белком флуорофора. При этом белок с адсорбированным флуорофором переводили в растворенное состояние, ресуспендируя полученный белковый осадок в свежей порции ДИ воды. В образцах супернатанта и растворенного комплекса БСА-флуорофор определяли количество флуоресцирующего компонента (Varian Cary Eclipse) по интенсивности световой эмиссии при 440 нм после возбуждения длиной волны 360 нм. После этого образец растворенного в воде комплекса БСА-флуорофор подвергали термической обработке при 100°С в течение 5 мин и затем удаляли денатурировавший белок центрифугированием при указанных выше условиях. В полученном супернатанте вновь определяли количество флуорофора по интенсивности флуоресценции.

Для визуализации световой эмиссии флуорофора на живых клетках использовали пекарские дрожжи S. cerevisiae. К порошку дрожжей S. cerevisiae добавляли 50 мМ фосфатный буфер (pH 6,0), образец перемешивали и инкубировали при температуре 25°С в течение 30 мин для перевода клеток в жизнеспособное состояние. После этого клетки собирали центрифугированием при 5000 g (Centrifuge 5415R) в течение 5 мин при 22°С. Полученный супернатант удаляли, а осадок клеток ресуспендировали в ДИ воде. Полученную клеточную суспензию доводили ДИ водой до оптической плотности 0,6 опт. ед. при λ = 600 нм. Аликвоту дрожжевой суспензии смешивали с водным раствором флуорофора в объемном соотношении 5:1. Полученную смесь инкубировали при 25°С в течение 20 мин, после чего клетки вновь собирали центрифугированием как указано выше. Супернатант удаляли, а образовавшийся осадок клеток дважды промывали ДИ водой для более полного удаления флуорофора, не адсорбированного дрожжевыми клетками. Для этого клеточный осадок каждый раз ресуспендировали в новой порции ДИ воды и собирали центрифугированием при указанных выше условиях. Отмытые клетки ресуспендировали в небольшом (50 мкл) объеме ДИ воды и 10 мкл полученной суспензии наносили на предметное стекло для микроскопирования.

Адсорбцию флуорофора на сорбенты небиологической природы проводили следующим способом. К порошкам DEAE-целлюлозы и QAE-сефадекса добавляли ДИ воду, после чего перемешивали и инкубировали полученные смеси при температуре 22°С в течение 24 ч для набухания гранул. Поскольку частицы бёмита (γ-AlO(OH)) не требуют аналогичной подготовки, для экспериментов гидрозоль этого сорбента готовили добавлением ДИ воды к сухому порошку и перемешиванием смеси до однородной суспензии. Аликвоты водных суспензий частиц DEAE-целлюлозы, гранул QAE-сефадекса (концентрации сорбентов 1 мг/мл) и гидрозоля частиц бёмита (концентрация сорбента 10 мг/мл) смешивали с аликвотами водного раствора флуорофора в объемном соотношении 5:1 (суспензия сорбента: раствор флуорофора) и инкубировали 20 мин при 25°С. Затем гранулы и частицы сорбентов собирали центрифугированием образцов при 3000 g (Centrifuge 5415R) в течение 5 мин при 4°С. В образцах супернатантов определяли количество флуоресцирующего компонента (Varian Cary Eclipse) по интенсивности световой эмиссии при 440 нм после возбуждения длиной волны 360 нм. Полученные осадки дважды промывали ДИ водой для удаления не связавшихся с адсорбентами молекул флуорофора. Для этого осадки гранул и частиц с адсорбированным флуоресцирующим компонентом каждый раз ресуспендировали в новой порции ДИ воды и собирали центрифугированием при указанных выше условиях. Осадки отмытых сорбентов ресуспендировали в небольших (по 50 мкл) объемах ДИ воды и по 10 мкл полученных суспензий наносили на предметные стекла для микроскопирования.

Все препараты, полученные в ходе изложенных выше экспериментов, просматривали на световом микроскопе Axio Imager M2 (Carl Zeiss, Германия) в светлом поле и в режиме флуоресценции с набором фильтров 49 (365 nm excitation filter, 445–450 nm emission filter), объективами N-Achroplan 10x/0,25 M27 и Plan-Neofluar 100/1,30 Oil M27.

Статистическая обработка данных по интенсивности свечения флуорофора при микроскопировании препаратов была выполнена с помощью программы ZEN 2012 (blueedition) (CarlZeiss, Германия). Интенсивность флуоресценции рассчитывали на единицу площади носителя (мкм2) за 1 сек. Измерения проводили в пяти повторностях.

Известно, что квантовый выход флуоресценции является одной из важнейших фотофизических характеристик вещества, обладающего флуоресцентными свойствами

Рисунок 1 - Спектры флуоресценции (а) и зависимости интегральной интенсивности флуоресценции от величины поглощения (б) водных растворов НАДН и флуоресцирующего компонента из базидиомицета N. nambi

Примечание: в спектрах флуоресценции значения нормированы на соответствующие максимальные уровни световой эмиссии

DOI:10.60797/IRJ.2025.156.51.1

В ходе исследований мы установили, что обнаруженный нами внеклеточный флуоресцирующий в синей области спектра компонент взаимодействует с биологическими и небиологическими носителями разной физико-химической природы и структурно-морфологической организации. В экспериментах было показано, что флуорофор адсорбируется: на ионообменные носители с разными типами привитых ионогенных групп — DEAE-целлюлозу и QAE-сефадекс, на частицы бёмита — оксигидроксид алюминия (γ-AlO(OH)), на молекулы модельного белка БСА и клетки дрожжей S. cerevisiae. Во всех рассматриваемых случаях флуорофор связывался с сорбентами достаточно прочно и не элюировался при промывках ДИ водой. При этом было установлено, что связанный с носителями флуорофор обладал способностью световой эмиссии в синей области спектра, что подтверждается результатами просмотра образцов в режиме флуоресценции на микроскопе Axio Imager M2 (рис. 2).

Рисунок 2 - Внешний вид (столбец 1) и флуоресценция (столбец 2) разных типов носителей с адсорбированным синим флуорофором из базидиомицета N. nambi: 

а, б – DEAE-целлюлоза; в, г – QAE-сефадекс; д, е – бёмит (γ-AlO(OH)); ж, з – клетки дрожжей S. cerevisiae

Примечание: масштабная риска на изображениях «а - е» - 100 мкм, «ж,з» - 10 мкм

DOI:10.60797/IRJ.2025.156.51.2

В экспериментах по адсорбции флуорофора из гриба N. nambi на сорбенты небиологической природы было установлено, что флуорофор эффективно связывается с ионообменными носителями. В ходе исследований на примере DEAE-целлюлозы было показано, что при использованных экспериментальных условиях (смешивание водной суспензии сорбента с концентрацией частиц 1 мг/мл и водного раствора флуорофора в объемном соотношении 5:1 и последующая инкубация смеси 20 мин при 25°С) на DEAE-целлюлозу адсорбируется около 60% исходной флуоресцентной метки (рис. 3). В свою очередь, как следует из представленных данных, отмывка ДИ водой частиц DEAE-целлюлозы с адсорбированным флуорофором не сопровождается его десорбцией, что свидетельствует в пользу прочного связывания флуоресцирующего компонента с сорбентом.

Рисунок 3 - Интенсивность флуоресценции, отражающая эффективность и прочность связывания флуоресцирующего компонента из гриба N. nambi на частицах DEAE-целлюлозы:

1 – исходный раствор флуорофора; 2 – супернатант после инкубации флуорофора с частицами сорбента и последующего их осаждения центрифугированием; 3 – супернатант после промывки частиц носителя ДИ водой и последующего их осаждения центрифугированием

Примечание: за 100% принят уровень световой эмиссии исходного раствора флуорофора

DOI:10.60797/IRJ.2025.156.51.3

При изучении связывания флуоресцентного компонента из гриба N. nambi с белковыми молекулами было показано, что инкубация флуорофора в водном растворе БСА сопровождается его эффективной адсорбцией на молекулы белка. Как видно из полученных данных (рис. 4), при использованных в работе экспериментальных условиях с белком связывалось до 50% молекул флуорофора от его общего количества в пробе. Однако по данным тестирования уровней флуоресценции полученных водных растворов, содержащих комплекс БСА-флуорофор, показано, что только 30–38% молекул использованного для адсорбции флуорофора обеспечивают эмиссию в синей области спектра. В то же время, при измерении уровня световой эмиссии супернатантов, полученных после термообработки содержащего комплекс БСА-флуорофор водных образцов при 100°С в течение 5 мин и удаления денатурировавшего белка центрифугированием, было показано, что с модельным белком было связано около 45–50% молекул флуорофора (рис. 4). Совокупность полученных результатов позволяет сделать предположение, что при адсорбции на молекулы белка часть молекул флуорофора может быть экранирована от воздействия возбуждающего излучения и, как следствие, не вносит вклад в регистрируемую интенсивность световой эмиссии в синей области спектра.

Рисунок 4 - Интенсивность флуоресценции, отражающая эффективность адсорбции флуорофора из базидиомицета N. nambi на модельном белке БСА:

1 – исходный раствор флуорофора; 2 – супернатант после смешивания растворов флуорофора и модельного белка с последующим его осаждением сульфатом аммония и удалением центрифугированием; 3 – раствор комплекса БСА-флуорофор; 4 – супернатант после обработки комплекса БСА-флуорофор при 100°С в течение 5 мин и последующего удаления денатурировавшего белка центрифугированием

Примечание: за 100% принят уровень световой эмиссии исходного раствора флуорофора

DOI:10.60797/IRJ.2025.156.51.4

Выше мы сообщали, что флуоресцирующий в синей области спектра компонент из базидиального гриба N. nambi адсорбируется на сложно организованных биологических объектах – живых клетках дрожжей S. cerevisiae. Было показано, что флуорофор связывается с клетками дрожжей достаточно прочно (не десорбируется при промывках клеток ДИ водой) и обладает флуоресценцией в синей области спектра (рис. 2). Известно, что клетки дрожжей самостоятельно флуоресцируют в синей области спектра за счет наличия, в частности, восстановленных пиридиновых нуклеотидов (НАДН и НАДФН), окисленных производных рибофлавина (ФАД и ФМН), являющихся кофакторами для многих ферментов

[20]

. Однако в наших экспериментах было показано, что интенсивность световой эмиссии в синей области спектра, регистрируемая у клеток дрожжей, проинкубированных с флуорофором и отмытых ДИ водой, была выше аналогичного показателя контрольных клеток в 2-2,5 раза.

В целом, результаты статистического анализа данных, полученных при изучении адсорбции изучаемого грибного флуорофора на разных объектах (сорбентах) биологической и не биологической природы, суммированы в таблице. Как следует из представленных результатов, во всех исследованных в работе случаях были выявлены различия в уровнях флуоресценции между контрольными и опытными образцами сорбентов, которые отражают эффективность связывания ими флуоресцирующего компонента из базидиомицета N. nambi. При этом видно, что после инкубации с флуорофором наибольшим уровнем флуоресценции в синей области спектра обладали: БСА, частицы DEAE-целлюлозы и гранулы QAE-сефадекса — по сравнению с контролем, прирост интенсивности их флуоресценции составил более чем в 50, 35 и 10 раз соответственно. В то же время, адсорбция флуорофора на клетки дрожжей S. cerevisiae и частицы бёмита сопровождалась существенно меньшим увеличением интенсивности их флуоресценции — примерно в 2–2,5 и 2,5–3 раза соответственно.

Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что низкомолекулярный термостабильный флуорофор, выделенный из базидиомицета N. nambi и излучающий свет в синей области спектра, адсорбируется на разных объектах биологической и небиологической природы (белковые молекулы, живые клетки, разные типы сорбентов) и проявляет свои флуоресцентные свойства после связывания с носителями. После адсорбции флуорофора наибольшим уровнем флуоресценции в синей области спектра обладали: БСА, частицы DEAE-целлюлозы и гранулы QAE-сефадекса — по сравнению с контролем, прирост интенсивности их флуоресценции составил более чем в 50, 35 и 10 раз соответственно. Изучаемый флуорофор имеет квантовый выход 0,04, уровень которого достаточен для визуализации объектов и образцов в режиме флуоресценции при микроскопировании. При этом следует сказать, что природные флуорофоры, характеризуясь отсутствием токсичности для живых клеток, зачастую имеют невысокий квантовый выход

В целом, результаты проведенных исследований открывают перспективы дальнейшего изучения применимости флуорофора из базидиального гриба N. nambi с эмиссией в синей области спектра в качестве нового флуоресцентного маркера для аналитических приложений.