CHLORIDE IONS HAVE A REGULATORY EFFECT ON SERUM HYALURONIDASE

Research article
DOI:
https://doi.org/10.60797/IRJ.2024.144.55
Issue: № 6 (144), 2024
Suggested:
12.04.2024
Accepted:
14.05.2024
Published:
17.06.2024
76
2
XML
PDF

Abstract

The aim of this study was to determine the effect of chlorine ions on the hyaluronidase activity of rat blood serum. We have previously shown that both sodium and potassium chloride can exert a regulatory effect on the enzyme, stimulating the growth of hyaluronidase activity at low concentrations and inhibiting hyaluronidase activity at high concentrations. Since this effect was characteristic of sodium and potassium chlorides, it was of interest to find out how salts of other halogens of these cations affect serum hyaluronidase activity. It was demonstrated that the addition of sodium fluoride or potassium bromide to the incubation medium did not cause activation of the enzyme. It is concluded that chlorine ions are more likely than sodium and potassium cations to influence serum hyaluronidase.

1. Введение

Гиалуроновая кислота (гиалуронан) является гликозаминогликаном, состоящим из многократно повторяющихся дисахаридных звеньев, включающих D-глюкуроновую кислоту и N-ацетил-D-глюкозамин. Размеры этого полимера могут достигать 107 Да

,
. Являясь основным структурным компонентом межклеточного матрикса, она может находиться как в высокополимерном состоянии, так и в виде фрагментов гораздо меньшего размера. Несмотря на простоту строения, интерес к этой молекуле не только не ослабевает, но все больше возрастает, поскольку, если раньше роль гиалуроновой кислоты сводилась только к гидратации тканей, то исследования последних лет демонстрируют участие этого полимера в целом ряде как физиологических так и патологических процессов, протекающих в человеческом организме. Причем, в зависимости от размера молекулы, влияние может быть противоположным. Так, гиалуронан с высокой молекулярной массой проявляет антиангиогенные и противовоспалительные свойства, в то время как гиалуронан с низкой молекулярной массой, наоборот, обладает ангиогенными и провоспалительными эффектами
,
.

Фрагментация и деградация гиалуроновой кислоты обеспечивается, в основном, гиалуронидазами 1-го и 2-го типов

. Гиалуронидаза 1-го типа была первой соматической гиалуронидазой, выделенной из сыворотки крови в чистом виде и охарактеризованной. Этот фермент активен в кислой среде, поэтому считается лизосомальным
,
. Несмотря на то, что с тех пор прошло достаточно много времени, до сих пор до конца не ясно, каково значение циркуляции этого фермента с кислым рН-оптимумом в кровеносном русле. Предполагается, что не все ткани, демонстрирующие гиалуронидазную активность, способны синтезировать гиалуронидазу 1-го типа, а могут получать фермент из кровеносного русла в результате эндоцитоза
. В этой связи изучение факторов, оказывающих влияние на активность сывороточной гиалуронидазы представляется актуальной задачей.

Ранее нами было показано, что хлорид натрия оказывал существенное влияние на гиалуронидазу,  активность  которой определяли в сыворотке крови крыс линии Вистар. Было продемонстрировано, что внесение в среду инкубации низких концентраций соли вызывало рост активности фермента, но когда концентрация соли превышала 100 мМ, можно было наблюдать постепенное снижение активности гиалуронидазы в зависимости от концентрации соли. При замене хлорида натрия на хлорид калия динамика изменения сывороточной гиалуронидазной активности была одинаковой

. В связи с этим представляло интерес выяснить, будут ли соли других галогенов этих катионов оказывать аналогичное влияние на сывороточную гиалуронидазную активность.

2. Методы и принципы исследования

Эксперименты проводились на самцах белых крыс линии Вистар весом 200-300 г, содержавшихся в условиях вивария. Животных декапитировали, после чего собирали кровь, давали ей свернуться, а затем центрифугировали при 600 g и температуре 40С в течение 5 минут. Сыворотку отбирали и использовали для проведения опытов, или хранили в замороженном при -200С виде до дня применения в экспериментах. Все процедуры, выполненные с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ.

Образцы инкубировали в течение 3 часов при 370С в присутствии гиалуроновой кислоты (0,5 мг/мл), после чего активность гиалуронидазы сыворотки крови определяли при помощи флюориметрического метода Моргана-Эльсона в модификации Такахаши

. Длина волны возбуждения  – 545 нм, эмиссии - 602 нм (Флюорат – 2М, ЛЮМЭКС, Санкт-Петербург, Россия). Сопутствующую экзогидролазную активность подавляли добавлением в среду инкубации 0.03 М слизевой кислоты. Единицей ферментативной активности считалось то количество фермента, которое при данных условиях реакции приводило к образованию 1 микромоля концевого n-ацетилглюкозамина в течение 1 минуты.

Статистическая оценка достоверности отличий полученных результатов проводилась при помощи t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений. Результаты, представленные в статье являются средними значениями ± ошибка среднего (M±m).

3. Результаты и их обсуждение

На рисунке №1 показана динамика изменения сывороточной гиалуронидазной активности при добавлении в среду инкубации разных концентраций хлорида и фторида натрия (0, 50, 100 и 200 мМ). Как видно из рисунка №1, если с увеличением концентрации хлорида натрия до 100 мМ наблюдался достоверный рост ферментативной активности, то в присутствии соответствующих концентраций фторида натрия подобный эффект отсутствовал. При одинаковой концентрации 100 мМ хлорид натрия вызывал рост активности гиалуронидазы в 2-2,5 раза, в то время как добавление фторида натрия вызывало тенденцию к снижению ее активности. При увеличении концентрации до 200 мМ хлорид натрия так же как и фторид натрия вызывали снижение активности сывороточной гиалуронидазы. Однако, если хлорид натрия снижал активность фермента до значений, сопоставимых с контрольными, то фторид натрия вызывал почти полное подавление ферментативной активности.
Влияние хлорида и фторида натрия на  активность гиалуронидазы сыворотки крови крыс линии Вистар

Рисунок 1 - Влияние хлорида и фторида натрия на  активность гиалуронидазы сыворотки крови крыс линии Вистар

Примечание: звездочкой обозначены достоверные отличия при p < 0,05 по сравнению с контролем на обоих графиках; треугольником обозначены достоверные отличия при p < 0,05 между хлоридом и фторидом натрия в каждой точке; результаты представляют средние значения 6 отдельных экспериментов

Аналогичная картина обнаруживалась при сравнении графиков зависимости сывороточной гиалуронидазной активности от различных концентраций хлорида и бромида калия (Рис. 2). Так же как и фторид натрия, по сравнению с хлоридом натрия, бромид калия, по сравнению с хлоридом калия, не оказывал стимулирующего влияния на сывороточную гиалуронидазную активность при концентрации 100 мМ, а при концентрации 200 мМ подавлял ферментативную активность в гораздо большей степени, нежели хлорид калия.
 Влияние хлорида и бромида калия на  активность гиалуронидазы сыворотки крови крыс линии Вистар

Рисунок 2 - Влияние хлорида и бромида калия на  активность гиалуронидазы сыворотки крови крыс линии Вистар

Примечание: звездочкой обозначены достоверные отличия при p < 0,05 по сравнению с контролем на обоих графиках; треугольником обозначены достоверные отличия при p < 0,05 между хлоридом и бромидом калия в каждой точке; результаты представляют средние значения 6 отдельных экспериментов

Таким образом, в отсутствие ионов хлора как натрий, так и калий не вызывали достоверного роста гиалуронидазной активности, несмотря на тенденцию к некоторому увеличению при концентрации 50 мМ. Активирующее влияние хлорида натрия на сывороточную гиалуронидазную активность с максимумом в районе 100 мМ известно достаточно давно
. Тем не менее возникал вопрос о том, с анионами хлора связано это влияние, или же с катионами натрия? Как было показано нами ранее, замена натрия на калий никак не влияла на график зависимости сывороточной гиалуронидазы от концентрации катиона. Хлорид калия, так же как и хлорид натрия, вызывал значительный рост гиалуронидазной активности, достигающий максимальных значений при 100 мМ
. В то же время, как показывают результаты данной работы, замена ионов хлора на другие галогены не вызывала достоверного увеличения активности фермента ни у солей натрия, ни у солей калия, что указывает на определяющую роль ионов хлора в активировании сывороточной гиалуронидазы. Увеличение концентрации галогенидов натрия и калия до 200 мМ вызывало снижение гиалуронидазной активности, что также хорошо согласуется с литературными данными о влиянии хлорида натрия на гиалуронидазную активность сыворотки крови. Однако, по сравнению с хлоридами, фториды и бромиды этих катионов оказывали гораздо больший ингибирующий эффект, и, почти полностью, подавляли активность сывороточной гиалуронидазы, что также подчеркивает особую роль хлоридов в регуляции ферментативной активности сывороточной гиалуронидазы.

4. Заключение

Ионы хлора необходимы для увеличения  активности гиалуронидазы, определяемой в крови крыс линии Вистар. Высокие концентрации хлоридов как натрия, так и калия оказывают гораздо меньший ингибирующий эффект на сывороточную гиалуронидазную активность белых крыс, по сравнению с фторидом натрия и бромидом калия. Разнонаправленное в зависимости от концентрации влияние хлорида натрия на активность гиалуронидазы сыворотки крови, очевидно, связано в большей степени с анионами хлора, чем с катионами натрия.

Article metrics

Views:76
Downloads:2
Views
Total:
Views:76