1. Введение
Гиалуроновая кислота (гиалуронан) является гликозаминогликаном, состоящим из многократно повторяющихся дисахаридных звеньев, включающих D-глюкуроновую кислоту и N-ацетил-D-глюкозамин. Размеры этого полимера могут достигать 107 Да [1], [2]. Являясь основным структурным компонентом межклеточного матрикса, она может находиться как в высокополимерном состоянии, так и в виде фрагментов гораздо меньшего размера. Несмотря на простоту строения, интерес к этой молекуле не только не ослабевает, но все больше возрастает, поскольку, если раньше роль гиалуроновой кислоты сводилась только к гидратации тканей, то исследования последних лет демонстрируют участие этого полимера в целом ряде как физиологических так и патологических процессов, протекающих в человеческом организме. Причем, в зависимости от размера молекулы, влияние может быть противоположным. Так, гиалуронан с высокой молекулярной массой проявляет антиангиогенные и противовоспалительные свойства, в то время как гиалуронан с низкой молекулярной массой, наоборот, обладает ангиогенными и провоспалительными эффектами [3], [4].
Фрагментация и деградация гиалуроновой кислоты обеспечивается, в основном, гиалуронидазами 1-го и 2-го типов [5]. Гиалуронидаза 1-го типа была первой соматической гиалуронидазой, выделенной из сыворотки крови в чистом виде и охарактеризованной. Этот фермент активен в кислой среде, поэтому считается лизосомальным [6], [7]. Несмотря на то, что с тех пор прошло достаточно много времени, до сих пор до конца не ясно, каково значение циркуляции этого фермента с кислым рН-оптимумом в кровеносном русле. Предполагается, что не все ткани, демонстрирующие гиалуронидазную активность, способны синтезировать гиалуронидазу 1-го типа, а могут получать фермент из кровеносного русла в результате эндоцитоза [8]. В этой связи изучение факторов, оказывающих влияние на активность сывороточной гиалуронидазы представляется актуальной задачей.
Ранее нами было показано, что хлорид натрия оказывал существенное влияние на гиалуронидазу, активность которой определяли в сыворотке крови крыс линии Вистар. Было продемонстрировано, что внесение в среду инкубации низких концентраций соли вызывало рост активности фермента, но когда концентрация соли превышала 100 мМ, можно было наблюдать постепенное снижение активности гиалуронидазы в зависимости от концентрации соли. При замене хлорида натрия на хлорид калия динамика изменения сывороточной гиалуронидазной активности была одинаковой [9]. В связи с этим представляло интерес выяснить, будут ли соли других галогенов этих катионов оказывать аналогичное влияние на сывороточную гиалуронидазную активность.
2. Методы и принципы исследования
Эксперименты проводились на самцах белых крыс линии Вистар весом 200-300 г, содержавшихся в условиях вивария. Животных декапитировали, после чего собирали кровь, давали ей свернуться, а затем центрифугировали при 600 g и температуре 40С в течение 5 минут. Сыворотку отбирали и использовали для проведения опытов, или хранили в замороженном при -200С виде до дня применения в экспериментах. Все процедуры, выполненные с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ.
Образцы инкубировали в течение 3 часов при 370С в присутствии гиалуроновой кислоты (0,5 мг/мл), после чего активность гиалуронидазы сыворотки крови определяли при помощи флюориметрического метода Моргана-Эльсона в модификации Такахаши [10]. Длина волны возбуждения – 545 нм, эмиссии - 602 нм (Флюорат – 2М, ЛЮМЭКС, Санкт-Петербург, Россия). Сопутствующую экзогидролазную активность подавляли добавлением в среду инкубации 0.03 М слизевой кислоты. Единицей ферментативной активности считалось то количество фермента, которое при данных условиях реакции приводило к образованию 1 микромоля концевого n-ацетилглюкозамина в течение 1 минуты.
Статистическая оценка достоверности отличий полученных результатов проводилась при помощи t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений. Результаты, представленные в статье являются средними значениями ± ошибка среднего (M±m).
3. Результаты и их обсуждение
Влияние хлорида и фторида натрия на активность гиалуронидазы сыворотки крови крыс линии Вистар
Влияние хлорида и бромида калия на активность гиалуронидазы сыворотки крови крыс линии Вистар
На рисунке №1 показана динамика изменения сывороточной гиалуронидазной активности при добавлении в среду инкубации разных концентраций хлорида и фторида натрия (0, 50, 100 и 200 мМ). Как видно из рисунка №1, если с увеличением концентрации хлорида натрия до 100 мМ наблюдался достоверный рост ферментативной активности, то в присутствии соответствующих концентраций фторида натрия подобный эффект отсутствовал. При одинаковой концентрации 100 мМ хлорид натрия вызывал рост активности гиалуронидазы в 2-2,5 раза, в то время как добавление фторида натрия вызывало тенденцию к снижению ее активности. При увеличении концентрации до 200 мМ хлорид натрия так же как и фторид натрия вызывали снижение активности сывороточной гиалуронидазы. Однако, если хлорид натрия снижал активность фермента до значений, сопоставимых с контрольными, то фторид натрия вызывал почти полное подавление ферментативной активности.Аналогичная картина обнаруживалась при сравнении графиков зависимости сывороточной гиалуронидазной активности от различных концентраций хлорида и бромида калия (Рис. 2). Так же как и фторид натрия, по сравнению с хлоридом натрия, бромид калия, по сравнению с хлоридом калия, не оказывал стимулирующего влияния на сывороточную гиалуронидазную активность при концентрации 100 мМ, а при концентрации 200 мМ подавлял ферментативную активность в гораздо большей степени, нежели хлорид калия.Таким образом, в отсутствие ионов хлора как натрий, так и калий не вызывали достоверного роста гиалуронидазной активности, несмотря на тенденцию к некоторому увеличению при концентрации 50 мМ. Активирующее влияние хлорида натрия на сывороточную гиалуронидазную активность с максимумом в районе 100 мМ известно достаточно давно [6]. Тем не менее возникал вопрос о том, с анионами хлора связано это влияние, или же с катионами натрия? Как было показано нами ранее, замена натрия на калий никак не влияла на график зависимости сывороточной гиалуронидазы от концентрации катиона. Хлорид калия, так же как и хлорид натрия, вызывал значительный рост гиалуронидазной активности, достигающий максимальных значений при 100 мМ [9]. В то же время, как показывают результаты данной работы, замена ионов хлора на другие галогены не вызывала достоверного увеличения активности фермента ни у солей натрия, ни у солей калия, что указывает на определяющую роль ионов хлора в активировании сывороточной гиалуронидазы. Увеличение концентрации галогенидов натрия и калия до 200 мМ вызывало снижение гиалуронидазной активности, что также хорошо согласуется с литературными данными о влиянии хлорида натрия на гиалуронидазную активность сыворотки крови. Однако, по сравнению с хлоридами, фториды и бромиды этих катионов оказывали гораздо больший ингибирующий эффект, и, почти полностью, подавляли активность сывороточной гиалуронидазы, что также подчеркивает особую роль хлоридов в регуляции ферментативной активности сывороточной гиалуронидазы.
4. Заключение
Ионы хлора необходимы для увеличения активности гиалуронидазы, определяемой в крови крыс линии Вистар. Высокие концентрации хлоридов как натрия, так и калия оказывают гораздо меньший ингибирующий эффект на сывороточную гиалуронидазную активность белых крыс, по сравнению с фторидом натрия и бромидом калия. Разнонаправленное в зависимости от концентрации влияние хлорида натрия на активность гиалуронидазы сыворотки крови, очевидно, связано в большей степени с анионами хлора, чем с катионами натрия.