SPECTROPHOTOMETRIC CONTENT ANALYSIS OF S-ALKYL CYSTEINE DERIVATIVES AS A BACTERICIDAL IMPACT FACTOR OF VARIOUS FORMS OF ALLIUM SATIVUM L.

ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ / CHEMISTRY

DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2022.120.6.109

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ S-АЛКИЛ ПРОИЗВОДНЫХ ЦИСТЕИНА КАК ФАКТОРА БАКТЕРИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ALLIUMSATIVUML.

Научная статья

Александрова П.А.¹,Иванова И.С.^2, *, Попов А.С.³, Бейшебаева Ч.Р.⁴

²ORCID: 0000-0001-7880-9756;

³ORCID: 0000-0002-9692-0009;

^{1, 2, 3, 4} Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия

* Корреспондирующий автор (ivanovaira1[at]yandex.ru)

Аннотация

Изучено влияние присутствия S-алкил производных цистеина на бактерицидные и бактериостатические свойства чеснока AlliumsativumL. в его различных формах: свежего, высушенного и ферментированного. Для количественного определения содержания S-производных в масляном экстракте использован метод спектрофотометрии на длине волны 662 и 669 нм. Для подтверждения бактерицидных свойств чеснока было проведено исследование, в котором наблюдалось воздействие свежего, ферментированного и высушенного чеснока на эпидермальный стафилококк Staphylococcusepidermidis. Бактерицидные свойства сравнивали с антибиотиком пенициллином. Показана достоверная корреляция содержания S-алкил производных цистеина с бактерицидным действием чеснока. Сделан вывод о том, что наиболее интенсивно рост колоний подавляет свежий чеснок, потому, что при ферментировании и высушивании данного растения изучаемые вещества теряют свою активность из-за уменьшения концентрации.

Ключевые слова: S-алкил производные цистеина,аллицин, чеснок, антибактериальные свойства, спектрофотометрия.

SPECTROPHOTOMETRIC CONTENT ANALYSIS OF S-ALKYL CYSTEINE DERIVATIVES AS A BACTERICIDAL IMPACT FACTOR OF VARIOUS FORMS OF ALLIUM SATIVUM L.

Research article

Aleksandrova P.A.¹, Ivanova I.S.^2, *, Popov A.S.³, Bejshebaeva CH.R.⁴

² ORCID: 0000-0001-7880-9756;

³ ORCID: 0000-0002-9692-0009;

^{1, 2, 3, 4} Mechnikov North-West State Medical University, Saint Petersburg, Russia

* Corresponding author (ivanovaira1[at]yandex.ru)

Abstract

The influence of the cysteine S-alkyl derivatives on the bactericidal and bacteriostatic properties of Allium sativum L. garlic in its various forms: fresh, dried and fermented. The method of spectrophotometry at a wavelength of 662 and 669 min was used to quantify the content of S-derivatives in the oil extract. To establish the bactericidal properties of garlic, a study was conducted which observed the effect of fresh, fermented and dried garlic on the epidermal Staphylococcus epidermidis. The bactericidal properties were compared with antibiotic penicillin. The correlation of S-alkyl derivatives of cysteine content with the bactericidal effect of garlic was shown. It is concluded that the most intensive colonies growth suppresses fresh garlic, because the plant, in its fermented and dried form, loses its activity due to a decrease in concentration.

Keywords: S-alkyl derivatives, cysteine, allicin, garlic, antibacterial properties, spectophotometery.

Введение

В настоящее время бактериальная резистентность является серьезной проблемой во всем мире. Для того чтобы появилась возможность противостоять росту устойчивости микроорганизмов к антибиотикам, необходимо проводить исследования с целью поиска новых источников, безопасных и эффективных противомикробных веществ, которые находятся в растениях. Объектом исследования в рамках данной темы мы выбрали AlliumSatiumL., растение известное как чеснок. С давних времен во всем мире чеснок использовали в качестве пищевого продукта и эффективного лекарственного средства против различных заболеваний. Он широко использовался на протяжении всей истории человеческой цивилизации. Трудно переоценить свойства чеснока, это растение обладает большим количеством ценных для человека компонентов с медицинской точки зрения. Важным преимуществом является доступность чеснока как для фармацевтических компаний, чтобы разрабатывать и синтезировать лекарственные препараты на его основе, так и для каждого человека, потребляющего чеснок в пищу. Данная тема актуальна, так как возможность использовать чеснок и его продукты для профилактики, предотвращения и терапии бактериальных инфекций позволит дополнить антибактериальную химиотерапию, что уменьшит количество побочных воздействий на организм человека.

Цели работы

• Установить как присутствие S-алкил производных цистеина в препаратах свежего, высушенного и ферментированного чеснока, так и определить изменение содержания указанных веществ в различных образцах.
• Выявить закономерности изменения бактерицидных и бактериостатических свойств для различных препаратов чеснока и сравнить их с влиянием пенициллина.

Химический состав AlliumsativumL., растения известного как чеснок, определяет его бактерицидные свойства. Чеснок содержит воду (62-68%), углеводы (26-30%), белки (1,5-2,1%), аминокислоты (1-1,5%), сероорганические соединения (1,1-3,5%), клетчатку (1,5%). Полисахариды, эфирные масла придают чесноку характерный вкус и запах. AlliumsativumL. также содержит витамин С: в листьях до 50 мг, в луковицах 8-10 мг, витамины В1, В2, РР, в листьях – каротин. Минеральный состав включает в себя фосфор, кальций, медь, магний, кремний, цинк, марганец. Ещё одним важным показателем элементного состава луковиц чеснока озимого является высокое содержание железа, среднее накопление элемента 14,6 мг/кг [1,2]. AlliumsativumL. содержит эфирное масло, которое находится в клетках растения в связанном виде и освобождается только после ферментативного расщепления.

Материалы и методы

Основными биологически-активными, обусловливающие фармакологическую ценность растения, компонентами чеснока являются сераорганические соединения. Спектрофотометрия выбрана как рабочий метод обнаружения и анализа содержания S-алкил производных, потому что этот метод в области 500-1100 нм позволяет определить как присутствие серосодержащих соединений, так и произвести количественное измерение их содержания в экстракте.

В настоящей работе была проведен спектрофотометрический анализ определения количества сульфидов в образцах AlliumsativumL. коэффициент поглощения регистрировался при помощи спектрофотометра СФ-2000 в диапазоне от 500 до 1100 нм по стандартной методике. Анализировался спектр пропускания экстракта AlliumsativumL. в растительное масло, при этом 10 г растительного материала экстрагировались в 50 мл масла, время экстрагирования выбрано 30 часов, при температуре 200⁰C, после этого экстракт отфильтровывался под вакуумом на стеклянном фильтре. Для получения статистически достоверных результатов, каждый вид растительного сырья приобретался в 3 экземплярах. Для каждого вида чеснока все сырье измельчалось (или гомогенизировалось), тщательно перемешивалось по всей массе, после чего отбиралась усредненная проба массой 10 г для приготовления экстракта.

Для подтверждения бактерицидных свойств чеснока было проведено исследование, в котором наблюдалось воздействие свежего (образец №1), ферментированного (образец №2) и высушенного чеснока (образец №3) на эпидермальный стафилококк (Staphylococcusepidermidis) – это сапрофитная флора кожных покровов и слизистой человека.

Бактериальную флору собрали с кожи рук при помощи стерильной ватной палочки, которую затем поместили в пробирку со стерильным физиологическим раствором. Посев бактерий «газоном» осуществлялся на универсальную питательную среду – мясопептонный агар (МПА). В центр чашки Петри №1 стерильной пипеткой внесли приготовленный экстракт образца №1, две капли. В чашку №1.2 внесли свежеприготовленный гомогенизат образца №1 весом 0,77 г. В центр чашки №2 внесли две капли экстракта образца №2, в чашку № 2.2 внесли гомогенизат этого же образца. Экстракт образца №3 внесли в чашку Петри №3. Для сравнительного анализа внесли диск с антибиотиком (пенициллином) в чашку с пометкой АБ (рис. 1). Чашку с отметкой «КР» оставили для контрольного роста бактериальных колоний. Чашки Петри поместили в термостат на 24 часа при 37⁰С (рис. 2). Все микробиологические исследования проводились в пяти параллельных чашках Петри, измерения эффектов проводились с точностью до 1 мм, в обсуждении представлены усредненные результаты по пяти образцам.

Результаты и обсуждение

Спектрофотометрически обнаружено резонансное увеличение поглощения излучения экстрактами AlliumsativumL. в диапазоне 650-700 нм, это указывает на присутствие различных сульфидов и S-алкил производных, электронный спектр поглощения которых имеет максимумы при 662 и 669 нм, что соответствует исследованию [3]. Состав масляных экстрактов, как по S-производным, так и по сопутствующим соединениям, является достаточно сложным, поэтому определить абсолютное содержание S-алкил производных цистеина не представилось возможным. Вместе с тем, анализ коэффициента поглощения на длине волны 662 нм (для масляных экстрактов) указывает на то, что содержание изучаемых S-производных уменьшается в последовательности: свежий чеснок >> сушеный чеснок > черный чеснок.

Луковицы чеснока содержат аллиин (alliin) (серо- и азотсодержащее соединение) в количестве 0,3% от веса свежего сырья или около 65-75% от общего количества серосодержащих веществ чеснока. В чистом виде аллиин – кристаллическое вещество, легко растворяется в воде, не обладает бактерицидными свойствами, достаточно стабильно, рис. 3.

С помощью C-S лиазного фермента аллииназы, который находится так же в тканях луковицы чеснока, аллиин превращается в аллицин (allicin) (диаллил-дисульфид-S-оксид). Аллицин – летучий фитонцид, смесь летучих ароматических соединений, состоящих из полисульфидов, которая является сильным антиоксидантом, избавляющим клетки от свободных радикалов.

Аллицин обладает очень сильными антибактериальными действиями – задерживает рост бактерий в разведении 1:125000. Аллицин реагирует с тиольными группами и может инактивировать ферменты [4,5]. Это вещество чрезвычайно реакционноспособное соединение и сразу же превращается в ряд активных соединений, одним из которых является аджоен.

Аджоен (ajoene) – 2-пропенил-3[3-(2-пропенилсульфинил)-1-пропенил]дисульфид – считается одним из наиболее активных компонентов экстрактивных веществ чеснока. Аджоен образуется в гомогенате или экстракте в результате декомпозиции аллицина. Благодаря наличию (Z)- и (E)-аджоенов и их производных, препараты чеснока оказывают противовоспалительное воздействие. Помимо аджоена аллицин превращается в такие соединения как: диаллилсульфид (diallylsulfide), диаллилдисульфид (diallyldisulfide), диаллилтрисульфид (diallylthreesulfide), винилдитиин (vinyldithiin) (рис. 3).

Указанные соединения проявляют бактерицидные и противовоспалительные действия [6,7,8]. Чеснок эффективно уничтожает бактерии таких видов, как стафилококки, сальмонеллы, вибрионы, микобактерии и протозои. Ростки чеснока - богатый источник ω -3 жирных кислот, индольных и фенольных веществ, которые обладают противовоспалительными и антиоксидантными свойствами [9].

В черном чесноке, в ходе ферментации формируется S-aллилцистеин (рис. 4) при катаболизме γ-глутамил-S-аллилоцистеина, по содержанию этого вещества определяют «возраст» черного чеснока. В процессе ферментации чеснок приобретает черный цвет во время брожения, при высокой температуре. Почернение обусловлено протеканием реакции Майяра, в результате которой происходит реакция между сахарами и аминокислотами с образованием меланоидинов. В процессе получение ферментированного чеснока происходит начальная потеря аллиина с образованием тиосульфинатов, что приводит к снижению образования аллицина, вещества, отвечающего за характерный запах и жгучий вкус свежего чеснока [10].

На питательной среде чашки Петри «КР» отметили рост грамм положительных и грамм отрицательных бактерий, что было выяснено при микрокопировании колоний (см. рис. 5).

На питательной среде чашки №1 наблюдали подавление роста колоний, аналогичное влиянию пенициллина. На расстоянии 1 см вокруг внесенного экстракта роста не было, а на остальной поверхности появилось умеренное количество колоний (см. рис. 6). В чашке Петри №1.2 на расстоянии 2,5 см вокруг внесенного образца рост не наблюдали, количество колоний на остальной поверхности значительно уменьшилось (см. рис. 7).

В чашке Петри №2 наблюдали интенсивный рост колоний по всей поверхности и в области нанесения экстракта (см. рис. 8). На питательной среде чашки №2.1 наблюдали интенсивный рост колоний, диапазон действия бактерицидных веществ составил 0,3 см вокруг образца (см. рис. 9).

На питательной среде чашки Петри №3 наблюдали умеренный рост колоний, диапазон действия составил 0,4 см.

Выводы

1. Спектрофотометрически на длине волны 662 нм установлено наличие S-алкил производных цистеина в масляных экстрактах чеснока как свежего, так и высушенного, и черного (ферментированного). Микробиологическое исследование указывает, что изучаемые S-производные проявляют бактериостатические и бактерицидные свойства по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям.
2. Наиболее интенсивно рост колоний подавляет свежий чеснок, это свидетельствует о том, что при ферментировании или высушивании данного растения, вещества, которые подавляют рост бактерий, частично теряют свою активность. Результаты количественного спектроскопического анализа содержания S-алкил производных цистеина согласуются с микробиологической оценкой бактериостатических и бактерицидных свойств различных форм чеснока.

Рис. 1 – Чашки Петри с внесенными образцами

Рис. 3 – Производные аллицина

Рис. 6 – Чашка Петри №1 (экстракт свежего чеснока)

Рис. 8 – Чашка Петри №2 (экстракт ферментированного чеснока)

Рис. 10 – Чашка Петри №3 (экстракт сушенного чеснока)

 

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Середин Т.М. Элементный состав чеснока озимого (AlliumsativumL.) сортов селекции ВНИИССОК / Т.М. Середин, А.Ф. Агафонов, Л.И. Герасимова и др. // Овощи России. - 2015. - №3 (28) – с. 81-85.
2. Hao Cheng. Extraction, characterisation and antioxidant activity of Allium sativum polysaccharide / Hao Cheng, Gangliang Huang // International Journal of Biological Macromolecules 114 (2018) 415–419.
3. Степанов Н. П. Спектрофотометрическое исследование экстрактов растений AlliumlineareL и AlliumnutansL в инфракрасной и видимой областях спектра / Н. П. Степанов, Г. М. Титова, А. С. Лозовская и др. // Учёные записки Забайкальского государственного университета. 2017. Т. 12, № 4. С. 80–87.
4. Берберова Н. Т. Синтез и биологическая активность органических моно-, ди- и полисульфидов / Н. Т. Берберова, Е. В. Шинкарь, И. В. Смолянинов и др. Монография. Издательство Южного научного центра Российской академии наук 344006, г. Ростов-на-Дону 2019г. С. 224-238
5. Martins N. Chemical composition and bioactive compounds of garlic (Allium sativum L.) as affected by pre- and post-harvest conditions: A review / Natаlia Martins, Spyridon Petropoulos, Isabel C.F.R. Ferreira // Food Chemistry 211 (2016) 41–50
6. Sulin Choo. Review: antimicrobial properties of allicin used alone or in combination with other medications / Sulin Choo, Voon Kin Chin, Eng Hwa Wong et al. // Folia Microbiologica (2020) 65:451–465
7. Lawson L.D. Allicin Bioavailability and Bioequivalence from Garlic Supplements and Garlic Foods / Larry D. Lawson, Scott M. Hunsaker // Mérieux NutriSciences Corporate Office (Silliker, Inc.), 111 E.Wacker Dr. Ste. 2300, Chicago, IL 60601, USA.
8. El-Saber Batiha G. Chemical Constituents and Pharmacological Activities of Garlic (Allium sativum L.): A Review / Gaber El-Saber Batiha, Amany Magdy Beshbishy, Lamiaa G. Wasef et al. // Nutrients 2020, 12, 872. Received: 27 February 2020; Accepted: 12 March 2020; Published: 24 March 2020
9. Кароматов И.Д. Чеснок и заболевания внутренних органов / И.Д. Кароматов, К.Т. Тогбоев // Биология и интегративная медицина. № 11. С. 55-71.
10. Логунова А.С. Получение черного чеснока и исследование его состава / А.С. Логунова, Л.А. Бахолдина // Проблемы, перспективы биотехнологии и биологических исследований. - Барнаул: Издательство Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова 2016 №6. С. 74-78.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Seredin T.M. Elementnyj sostav chesnoka ozimogo (Allium sativum L.) sortov selekcii VNIISSOK [The elemental composition of winter garlic (Allium sativum L.) varieties of VNIISSOK selection] / T.M. Seredin, A.F. Agafonov, I. Gerasimova et al. // Ovoshchi Rossii [Vegetables of Russia]. - 2015. - №3 (28) – P. 81-85.[in Russian]
2. Hao Cheng. Extraction, characterisation and antioxidant activity of Allium sativum polysaccharide / Hao Cheng, Gangliang Huang // International Journal of Biological Macromolecules 114 (2018) 415–419.
3. Stepanov N. P. Spektrofotometricheskoe issledovanie ekstraktov rastenij Allium lineare L i Allium nutans L v infrakrasnoj i vidimoj oblastyah spektra [Spectrophotometric study of plant extracts of Allium lineare L and Allium nutans L in the infrared and visible spectral regions] / N. P. Stepanov, G. M. Titova, A. S. Lozovskaya et al. // Uchyonye zapiski Zabajkal'skogo gosudarstvennogo universiteta [Scientific notes of the Trans-Baikal State University]. 2017. Vol. 12, № 4. 80–87. [in Russian]
4. Berberova N. T. Sintez i biologicheskaya aktivnost' organicheskih mono-, di- i polisul'fidov[Synthesis and biological activity of organic mono-, di- and polysulfides] / N. T. Berberova, E. V. SHinkar', I. V. Smolyaninov et al. Publishing house YUzhnogo nauchnogo centra Rossijskoj akademii nauk 344006, g. Rostov-na-Donu 2019g. P. 224-238 [in Russian]
5. Martins N. Chemical composition and bioactive compounds of garlic (Allium sativum L.) as affected by pre- and post-harvest conditions: A review / Natаlia Martins, Spyridon Petropoulos, Isabel C.F.R. Ferreira // Food Chemistry 211 (2016) 41–50
6. Sulin Choo. Review: antimicrobial properties of allicin used alone or in combination with other medications / Sulin Choo, Voon Kin Chin, Eng Hwa Wong et al. // Folia Microbiologica (2020) 65:451–465
7. Lawson L.D. Allicin Bioavailability and Bioequivalence from Garlic Supplements and Garlic Foods / Larry D. Lawson, Scott M. Hunsaker // Mérieux NutriSciences Corporate Office (Silliker, Inc.), 111 E.Wacker Dr. Ste. 2300, Chicago, IL 60601, USA.
8. El-Saber Batiha G. Chemical Constituents and Pharmacological Activities of Garlic (Allium sativum L.): A Review / Gaber El-Saber Batiha, Amany Magdy Beshbishy, Lamiaa G. Wasef et al. // Nutrients 2020, 12, 872. Received: 27 February 2020; Accepted: 12 March 2020; Published: 24 March 2020
9. Karomatov I.D. CHesnok i zabolevaniya vnutrennih organov [Garlic and diseases of internal organs] / I.D. Karomatov, K.T. Togboev // Biologiya i integrativnaya medicina [Biology and integrative medicine]. 2019.№ 11. P. 55-71. [in Russian]
10. Logunova A.S. Poluchenie chernogo chesnoka i issledovanie ego sostava [Obtaining black garlic and studying its composition] / A.S. Logunova, L.A. Baholdina // Problemy, perspektivy biotekhnologii i biologicheskih issledovanij. [Problems and prospects of biotechnology and biological research.Barnaul]: Publishing house Altajskogo gosudarstvennogo tekhnicheskogo universiteta im. I.I. Polzunova 2016 №6. P. 74-78. [in Russian]