Enzymatic activity of cerium oxide nanoparticles in media with different acidity

Проблема продления нормальной жизнедеятельности организма была актуальна во все времена. На биохимическом уровне секрет долголетия кроется в наличие антиоксидантной защиты организма, обеспечивающей контроль свободно-радикальных реакций. Ключевым фактором в поддержании достаточного уровня резистентности организма в условиях окислительного стресса, участвующего в патогенезе многих заболеваний, играют особые вещества – антиоксиданты

Нанокристаллический диоксида церия проявляет химические свойства подобно энзимам, участвующим в реакциях нейтрализации экзогенных активных форм кислорода (АФК) в живых системах. С точки зрения физико-химических свойств данного соединения, эффект в системах in vitro и in vivo может быть обусловлен наличием кислородных вакансий в его структуре, а также двух стабильных степеней окисления

Поэтому целью данной работы стало исследование физико-химических свойств наночастиц оксида церия, стабилизированных мальтодекстрином, путем оценки их ферментативной активности в средах различной кислотности. Для этого была исследована мультиферментативная активность НДЦ в зависимости от водородного показателя буферного раствора.

Наночастицы диоксида церия были получены из раствора соли хлорида гептагидрата церия (III) путем химического осаждения. Для стабилизации НДЦ использовался мальтодекстрин, позволяющий получать устойчивые и нетоксичные золи

В основу изучения биологической активности наночастиц диоксида церия легла изображенная на рис.1 реакция окисления 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ), выступающего в роли субстрата, под действием пероксида водорода (a) в случае изучения пероксидазной активности и под действием кислорода (b) в ситуации, когда НДЦ выступают в качестве оксидазы.

Рисунок 1 - Механизм действия пероксидазы (a) и оксидазы (б) на субстрат ТМБ

DOI:10.60797/IRJ.2024.143.174.1

Нейтральный и кислый pH для моделирования внутренней среды живого организма были выбран, исходя из значений кислотности большинства биологических жидкостей организма человека (pH ≈ 6,7–7,3) и повышенной кислотности опухолевых клеток (pH ≈ 5,1–6,0) соответственно

[7]

.

Для анализа пероксидазной активности наночастиц CeO2 были измерены временные зависимости оптической плотности субстрата ТМБ после добавления в кювету пероксида водорода Н2О2

Регистрация кривых оптической плотности окисленного субстрата ТМБ проводилась в течение 10 минут с использованием спектрофотометра ПЭ-5400УФ («Экросхим»), состоящего из источников излучения, оптической системы, формирующей рабочие пучки, монохроматора, кюветного отделения, фотоприемника и электронно-регистрирующей микропроцессорной системы. Управление прибором производилось с внешнего компьютера. Измерения проводились на длине волны 652 нм.

По полученным данным были построены графики зависимостей концентрации продуктов окисления ТМБ от времени, пересчитанные по закону Бугера–Ламберта–Бера (1).

(1)

где А – оптическая плотность;

 ε – коэффициент молярного поглощения;

 L – толщина кюветы, равная 1 см.

Зависимости концентрации субстрата от скорости реакции, определенной по наклону касательной к графику концентрации продукта от времени, соответствуют модели Михаэлиса–Ментен (2).

(2)

Константа Михаэлиса, рассчитанная в ходе работы для оценки активности НДЦ, может быть определена по графику уравнения Лайнуивера–Берка (3), который получается путем линеаризации уравнения Михаэлиса–Ментен.

(3)

Пересечение прямой с осью 1/[С] в отрицательной области дает значение, равное -1/Кm, по которому определяется величина константы Михаэлиса.

Химизм реакций, протекающих с участием НДЦ, и, как следствие, их роль в биологических процессах организма, а именно взаимодействия энзима с субстратом, зависит от параметров окружающей среды, в том числе и водородного показателя раствора, в котором протекает реакция. Анализ влияния pH среды на биологическую активность НДЦ был проведен на основе кривых оптической плотности продуктов реакции окисления 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина (ТМБ) в дистиллированной воде (pH = 7,0) и ацетатном буферном растворе (pH = 5,1). В случае последнего оценка свойств велась посредством построения разностных графиков зависимостей оптической плотности от времени. Выбор данного буферного раствора обусловлен наибольшей степенью сходства его химического состава с внутренней средой биообъекта.

При увеличении доли ионов Се3+ свыше 40 % относительно валентного отношения Се3+/Се4+ НДЦ проявляют пероксидазную активность вследствие наличия на поверхности кристаллической решетки ионов Се3+. Для пероксидазы субстратом является не только пероксид водорода, но и неорганические или молекулы органического и неорганического происхождения, которые окисляются пероксидом водорода в его присутствии

Каталитическое восстановление пероксида водорода в присутствии молекулы ТМБ (наиболее распространенный субстрат пероксидазы), являющегося донором электронов, происходит в среде с нейтральным рН. В процессе реакции ТМБ окисляется в продукт, имеющий бирюзовую окраску и максимум оптического поглощения при 652 нм. Зависимость скорости каталитической реакции от концентрации субстрата имеет гиперболическую форму и соответствует уравнению ферментативной кинетики модели Михаэлиса-Ментен: реакция очень быстро протекает в первые минуты, после чего наступает этап субстратного насыщения, так называемое плато, что показано на рис. 2. На рис. 3 продемонстрировано применение способа линеаризации Лайнуивера-Берка.

Рисунок 2 - Кривая зависимости концентрации субстрата ТМБ от скорости реакции, подчиняющаяся уравнению Михаэлиса-Ментен

DOI:10.60797/IRJ.2024.143.174.2

Рисунок 3 - Кривая субстратного насыщения в обратных координатах

DOI:10.60797/IRJ.2024.143.174.3

Для оценки сродства фермента к субстрату необходимо оценить константу Михаэлиса – кинематический параметр, равный концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от ее максимальной величины, при этом половина исходного количества НДЦ находится в состоянии фермент-субстратного комплекса. Полученное в ходе расчета значение составило Km=0,98 ммоль/л. Значение Km изменяется в диапазоне 1 – 10-8 моль/л, т. е. в данном случае НДЦ проявляет сродство к хромогенному субстрату ТМБ, достаточное для использования НДЦ наряду с пероксидазой хрена в иммунологических тестах.

Как видно из рис. 4, по мере увеличения концентрации субстрата наблюдается смещение кинетических кривых в сторону больших значений концентраций продукта реакции. При достижении объема ТМБ порядка 80 мкл (концентрация ТМБ – 10 мг/мл) зафиксировано снижение значения оптической плотности, что указывает на то, что определенная концентрация вводимого субстрата препятствует пероксидазной активности НДЦ. Дальнейшее увеличение объема вводимого раствора ТМБ приводит к перенасыщению раствора и выпадению осадка, активность НДЦ в качестве пероксидазы начинает падать.

Рисунок 4 - Кинетические кривые зависимости окисленного ТМБ от времени при разных объемах вводимого субстрата

DOI:10.60797/IRJ.2024.143.174.4

При проведении реакции в ацетатном буфере (pH = 5,1) были зарегистрированы графики оптической плотности продукта реакции на длине волны 652 нм. Проявление активности НДЦ в отсутствии пероксида водорода Н2О2 свидетельствует о возникновении конкурирующих реакций, катализируемых оксидазой и пероксидазой, в случае введения в раствор Н2О2. Поведение разностных кривых зависит от объема добавленного субстрата: при его уменьшении заметно ингибирование реакции, катализируемой пероксидазой (рис. 5). Разложение пероксида водорода Н2О2 в присутствии НДЦ происходит в цикле окисления-восстановления: ионы Се3+, находящиеся на поверхности кристаллической решетки, окисляются, после чего взаимодействие Н2О2 с ионами Се3+ приводит к разложению молекулы до воды и кислорода. Эффективность восстановления НДЦ в кислой среде снижена, таким образом падает и скорость разложения Н2О2

[8]

.

Рисунок 5 - Кривые оптической плотности продукта для конкурирующих реакций при добавлении субстрата: 

а – 5 мкл ТМБ; б – 40 мкл ТМБ

DOI:10.60797/IRJ.2024.143.174.5

Результаты исследования показали, что наночастиц оксида церия способны выполнять функции ферментов пероксидазы и оксидазы. Проявление пероксидазного и оксидазного типов активностей сильно зависит от кислотности среды. Так, имитация поведения фермента пероксидазы наиболее активно происходит в среде с нейтральным рН, в то время как при снижении рН среды для наночастиц оксида церия характерны скорее оксидазоподобные свойства. В работе проанализированы особенности конкурирующих реакций, катализируемых наночастицами при имитации поведения ферментов оксидазы и пероксидазы. Обнаружено влияние объема субстрата на характер его окисления. Так, при уменьшении объема субстрата ТМБ обнаружено ингибирование реакции, катализируемой пероксидазой.

Проведена оценка значения константы Михаэлиса для пероксидазного типа активности и показано, что наночастицы диоксида церия проявляет сродство к хромогенному субстрату ТМБ, достаточное для их использования наряду с пероксидазой хрена в иммунологических тестах.

Полученные результаты могут являться основой для уточнения механизма механизмов мультиферментативной активности наночастиц оксида церия, особенно в условиях разной кислотности биологических сред.