APPLICATION OF THE LACTOFERRICIN ANTIMICROBIAL PEPTIDE TEST IN APPENDICITIS AND PERITONITIS

Перитонит был и остается важнейшим фактором в структуре летальности хирургических пациентов с бактериальной абдоминальной инфекцией

В число значимых для хирургии антибактериальных компонентов иммунной системы относится железосодержащий белок лактоферрин (ЛФ)

В ранних работах для экспериментов и клинических испытаний мы использовали сложную многоступенчатую процедуру выделения ЛФЦ из индивидуальных образцов сывороток крови и перитонеального экссудате, включавшую кислотный гидролиз образцов пепсином в термостате в течение 4 часов при 37°С, последующую депротеинизацию образцов трихлоруксусной кислотой, отделение осадка центрифугированием, нейтрализацию фильтрате и определение концентрации лактоферрицина в пробах на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Результаты измерения выражали в единицах оптической плотности на мл

Цель исследования – оценка перспектив применения тест-системы для иммуноферментного анализа лактоферрицина для оценки уровней лактоферрина (ЛФ) и лактоферрицина (ЛФЦ) в сыворотках крови и перитонеальном экссудате у больных с острым осложненным аппендицитом.

Больные с деструктивными формами острого аппендицита проходили хирургическое лечение в ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница» г. Астрахани в период 2021-2023 годов. В соответствии с целью настоящей работы обследовано 44 пациентов обоего пола (21 мужчина и 24 женщины) в возрасте от 21 до 55 лет. Средний возраст обследованных пациентов основной группы составил 35,9±1,3 лет (36,2±2,1 лет среди мужчин и 35,6±1,6 лет среди женщин). Из исследования исключены пациенты с неосложненным (катаральным) острым аппендицитом, беременные женщины, пациенты с хроническими заболеваниями, изменяющими иммунный статус (туберкулез, ЗППП, ВИЧ-инфекции). По степени тяжести деструктивный аппендицит пациенты основной группы были распределены на три подгруппы: 20 больных с флегмонозным аппендицитом (по 10 мужчина и женщины), 14 больных с гангренозным аппендицитом (6 мужчина и 8 женщины), и 10 больных с распространенным аппендикулярным перитонитом (5 мужчина и 5 женщины). Средний возраст обследованных пациентов в подгруппе с флегмонозным аппендицитом составил 34,1±1,6 лет (33,9±2,5 лет среди мужчин и 34,2±2,3 лет среди женщин), в подгруппе с гангренозным аппендицитом составил 36,3±2,3 лет (37,3±3,8 лет среди мужчин и 35,5±3,1 лет среди женщин) и в подгруппе с аппендикулярным перитонитом составил 38,9±3,4 лет (39,4±5,4 лет среди мужчин и 38,4±4,8 лет среди женщин). По половому признаку достоверных различий между группами мужчин и женщин ни в одной из трех подгрупп опытной группы не установлено. В контрольную группу вошли 40 доноров крови (по 20 доноров каждого пола) в возрасте от 20 до 53 лет (средний возраст 32,9±1,7 года среди мужчин и 32,0±1,7 года среди женщин).

Всем 44 отобранным пациентам для установления диагноза «деструктивный аппендицит или аппендикулярный перитонит» при поступлении проводился общепринятый клинический осмотр с оценкой общего и локального статуса, выполнялись необходимые лабораторные и инструментальные методы обследования: общий анализ крови, мочи, УЗИ органов брюшной полости, обзорная рентгенография брюшной полости, грудной клетки, и стандартные биохимические анализы крови. Обследованным пациентам после кратковременной предоперационной подготовки быть выполнена или лапароскопическая (ЛСА) или открытая лапаротомная аппендэктомия (ЛТА). Лапароскопическую аппендэктомию выполняли с использованием трехпортовой техники. ЛСА выполнена 26 пациентам (59%, средний возраст пациентов 32,9±1,3 года), традиционная ЛТА – 18 больным (41%, средний возраст пациентов 40,1±4,0 года, различие между способами аппендектомии статистически незначимо). Средний возраст пациентов в подгруппе с флегмонозным аппендицитом, которым была выполнена ЛСА, составил 32,4±1,5 лет, а среди пациентов, которым проведена ЛТА – 37,8±4,1 лет. В подгруппе пациентов с гангренозным аппендицитом, которым была выполнена ЛСА, составил 34,5±2,6 лет, а среди пациентов, которым проведена ЛТА – 40,8±4,7 лет. Различия по возрасту пациентов в зависимости от способа аппендэктомии статистически не значимы во всех подгруппах, за исключением подгруппы пациентов с аппендикулярным перитонитом, где выявлена статистически значимые различия (p<0,05) по возрасту между пациентами, которым выполнена ЛСА (28,5±2,5 лет) или ЛТА (41,5±3,7 лет). При любом варианте оперативного лечения деструктивного аппендицита, после санации брюшной полости операция завершалась дренированием брюшной полости и антибиотикотерапией в послеоперационном периоде, пропорциональной степени тяжести состояния пациента. Во время операции или после установки дренажей выполнялся забор перитонеального экссудата для бактериологического посева выпота и специальных биохимических методов исследование. При распространенном аппендикулярном перитоните, осложненном выраженным парезом ЖКТ и септическим шоком, применялся только лапаротомный доступ, а программа послеоперационного лечения проводилась в отделении реанимации и интенсивной терапии АМОКБ. У всех 44 пациентов опытной группы апостериорно диагноз деструктивного аппендицита подтвержден результатами патогистологического исследования.

От всех пациентов, участвовавших в исследовании, получено информированное письменное согласие. Исследование одобрено на заседании Этического комитетета ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ МЗ РФ (протокол №23 от 30.11.2022 г.), соответствовало этическим стандартам, разработанным в соответствии с Хельсинкской декларацией.

В образцах сывороток крови и перитонеальном экссудате 44 больных с деструктивными формами аппендицита, наряду со стандартными клиническими, лабораторно-инструментальными методами исследования сопоставляли концентрации белка ЛФ и пептида ЛФЦ. Концентрацию ЛФ определяли набором реагентов для ИФА (Лактоферрин «Вектор-Бест» г. Новосибирск) с чувствительностью теста 1 нг/мл. Концентрацию ЛФЦ определяли с помощью, разработанного авторами способа получения моноспецифических кроличьих антител к пептиду лактоферрицину человека (патент РФ № 2795322) [9]. На основе полученных моноспецифических антител к лактоферрицину человека авторами сконструирована тест-система для иммуноферментного анализа ЛФЦ с чувствительностью теста 0,1 нг/мл.

Полученные данные обработаны методами описательной статистики с помощью программы Excel и представлены в таблице и графиках медианами (Me) и межквартильным размахом между 1 и 3 квартилями. Учитывая, что распределение в группах и подгруппах отличалось от нормального, достоверность различий между группами оценивали по непараметрическому критерию U Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р < 0,05

Данные сопоставления медиан концентраций лактоферрина и лактоферрицина в сыворотках крови у пациентов с различной степенью тяжести острого перитонита представлены в таблице (табл. 1).

Достоверные различия (p<0,05) со значениями медиан в контрольной группе 40 доноров установлены во всех группах пациентов с аппендицитом начиная от флегмонозных форм и кончая, аппендикулярным перитонитом, как для сывороточного ЛФ, так и для пептида ЛФЦ.

При этом при флегмонозном аппендиците уровни ЛФ и ЛФЦ превышали контрольные цифры на 264 и 204% соответственно, при гангренозном аппендиците уровни ЛФ и ЛФЦ превышали контрольные цифры на 386 и 257% соответственно и при аппендикулярном перитоните на 431 и 338% соответственно (в среднем группа из 44 больных с острым деструктивным аппендицитом отличалась от доноров в 3 раза и по ЛФ, и по ЛФЦ).

У пациентов, оперированных по поводу острого аппендицита, сопоставляли концентрации ЛФ и ЛФЦ в сыворотках крови, с жидкостью оттекающей по дренажам, установленным в брюшную полость. Концентрации белка в сыворотках и дренажной жидкости стандартизировали по концентрации белка. Установлено (табл. 1), что медианы концентрации ЛФ в перитонеальном экссудате всегда статистически достоверно (p<0,001) превышали сывороточные уровни ЛФ во всех группах пациентов с аппендицитом: при флегмонозном аппендиците в перитонеальном экссудате на 381% превышали контрольные цифры в сыворотке этих же больных, при гангренозном аппендиците в перитонеальном экссудате на 320% выше цифр в их же сыворотке и при аппендикулярном перитоните в перитонеальном экссудате на 300% выше цифр в сыворотке (в среднем группа из 44 больных с острым деструктивным аппендицитом отличалась от уровней ЛФ в перитонеальном экссудате этих же больных в 3,71 раза). Что касается лактоферрицина, то по этому пептиду различий у больных между концентрациями в сыворотке крови и перитонеальном экссудате ни в одном случае не установлено.

При изучении значений концентраций белка ЛФ и пептида ЛФЦ у пациентов с острым деструктивным аппендицитом нами установлено, что у всех пациентов цифры ЛФ и ЛФЦ многократно превышают контрольные цифры доноров и нарастают пропорционально степени тяжести состояния пациентов

Обнаруженные различия в эффектах лактоферрина и лактоферрицина при хирургической абдоминальной патологии на примере острого деструктивного аппендицита требуют дополнительного углубленного изучения антимикробных свойств лактоферрицина. Установленные факты следует учитывать при определении тактики лечения пациентов с ургентной хирургической патологией.

1. В данной работе нами показано, что при остром осложненном аппендиците, в том числе, осложненном перитонитом, наблюдаются статистически достоверное повышенные концентрации белка лактоферрина и пептида лактоферрицина относительно нормы и в сыворотке крови, и в перитонеальном экссудате.

2. У пациентов с острым деструктивным аппендицитом цифры лактоферрина в перитонеальном экссудате статистически достоверно в 3-4 раза превышают сывороточные уровни этих же больных, а цифры лактоферрицина в параллельных пробах между собой не отличаются.

3. По полученным в работе данным уровни ЛФ и ЛФЦ после лапароскопической аппендэктомии статистически достоверно не отличаются от уровней после лапаротомной аппендэктомии и зависят только от степени тяжести состояния пациентов.

4. Обнаруженные различия в эффектах лактоферрина и лактоферрицина при остром деструктивном аппендиците определяются различными механизмами антибактериального действия белка лактоферрина и пептида лактоферрицина. Более высокие цифры ЛФ в перитонеальном экссудате при деструктивном аппендиците, по сравнению с сывороточными концентрациями ЛФ, отражают роль железа в механизме бактерицидной и бактериостатической активности молекулы ЛФ в процессе транслокации эндогенного белка из кишечника в брюшную полость. У пептида ЛФЦ, не имеющего отношения к метаболизму железа, антимикробная активность связана со специфической структурой и аминокислотным составом ЛФЦ, проявляющейся в одинаковой степени и в крови, и в перитонеальном экссудате.