CHANGES IN HYALURONIDASE ACTIVITY UNDER THE INFLUENCE OF MAJOR BLOOD SERUM CATIONS
CHANGES IN HYALURONIDASE ACTIVITY UNDER THE INFLUENCE OF MAJOR BLOOD SERUM CATIONS
Abstract
The aim of the study was to determine how and whether the major blood cations sodium and potassium affect the activity of serum hyaluronidase in Wistar rats. Hyaluronidase activity was determined by the Morgan-Elson fluorimetric method modified by T. Takahashi. It was shown that the dynamics of serum hyaluronidase activity growth with increasing concentration of both cations was similar and reached maximum values in the region of 50-100 mM. In the presence of sodium there was a tendency to a slight increase in hyaluronidase activity compared to potassium. Further increase in the concentration of both sodium and potassium resulted in a decrease in serum hyaluronidase activity. It is concluded that sodium and potassium cations may have a regulatory effect on the enzyme, stimulating the increase in hyaluronidase activity at low concentrations and inhibiting hyaluronidase activity at high concentrations.
1. Введение
Научные данные последних лет по исследованию обмена гиалуроновой кислоты (ГК) в организме человека демонстрируют её активную роль не только в реализации физиологических функций, но и в ряде патологических состояний, в связи с чем дальнейшее изучение свойств и обмена данной молекулы является актуальной задачей .
Гиалуроновая кислота является основным компонентом соединительной ткани млекопитающих и человека, представляющим собой линейный гетерополисахарид, размеры которого достигают 1-2 МДа , . Синтез такой молекулы обеспечивается гиалуронансинтетазами различных клеток и сопровождается по мере элонгации цепи внутри клетки ее экстракцией во внеклеточное пространство, где она может подвергаться деградации под действием гиалуронидаз, главными из которых являются гиалуронидазы 1 и 2-го типов . Считается, что степень деградации гиалуроновой кислоты существенно меняет физико-химические свойства межклеточного матрикса, а образующиеся продукты деградации могут проявлять самые разные регуляторные эффекты. Так, например, высокополимерная гиалуроновая кислота обладает антиангиогенными свойствами, в то время как продукты деградации гиалуроновой кислоты размером 20 кДа, которые образуются под действием гиалуронидазы 2-го типа, наоборот, являются ангиогенными .
Гиалуронидазная активность плазмы крови очень высокая в крови человека. Считается, что этот фермент-гиалуронидаза 1-го типа (ГИАЛ1) является лизосомальным ферментом и проявляет максимальную активность в кислой среде . В сыворотке крыс также наблюдается максимальная гиалуронидазная активность по сравнению с печенью, почками, кожей и селезенкой . Поскольку циркулирующая в крови Hyal-1 находится в неактивном состоянии, на сегодняшний день не ясно, какую роль может выполнять столь значительная активность этого фермента и каковы способы его активирования. Одним из возможных способов создания рН-оптимума фермента предполагается появление на поверхности клеток органов так называемой гиалуроносомы – углубления цитоплазматической мембраны, куда секретируются протоны за счет катионных мембранных белков-переносчиков . В этой связи представляло интерес выяснить, как влияют главные катионы организма натрий и калий на гиалуронидазную активность сыворотки крови крыс.
Цель исследования — определить как изменяется гиалуронидазная активность сыворотки крови крыс в зависимости от концентрации ионов натрия и калия
2. Методы и принципы исследования
В экспериментах использовали самцов крыс линии Вистар массой 150-250 г, которые содержались на стандартной диете и свободном доступе к воде. После декапитирования кровь собирали, центрифугировали 5 минут при 600 g, отбирали сыворотку и использовали в экспериментах. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ и рекомендациям биоэтического комитета Института биомедицинских исследований Владикавказского Научного центра Российской академии наук.
Гиалуронидазную активность определяли флюориметрическим методом Моргана-Эльсона в модификации Т. Такахаши в условиях 3-х часового гидролиза при 37оС по конечному продукту N-ацетилглюкозамину . Активность сопутствующих экзогидролаз ингибировали 0.02М слизевой кислотой, добавляемой в реакционную смесь. Флюоресценцию измеряли при волне возбуждения – 545 нм, эмиссии – 602 нм (Флюорат – 2М, ЛЮМЭКС, Санкт-Петербург, Россия). За единицу активности гиалуронидазы принимали количество фермента, необходимого в данных условиях реакции для образования 1 микромоля концевого глюкозамина за 1 мин.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони. Данные выражали как средние значения ± ошибка среднего (M±m). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.
3. Основные результаты
Рисунок 1 - Влияние катионов натрия и калия на гиалуронидазную активность сыворотки крови крыс линии Вистар
Примечание: звездочкой обозначены достоверные отличия при p < 0,05 по сравнению с контролем на обоих графиках. Каждая точка представляет средние значения 7 отдельных экспериментов
4. Обсуждение
Высокая гиалуронидазная активность сыворотки крови, очевидно, обеспечивает эффективный процесс деградации гиалуроновой кислоты в кровеносном русле. Известно, что гиалуроновая кислота поглощается клетками при участии таких мембранных рецепторов как CD44, которые в комплексе с гиалуронидазой 2-го типа располагаются в инвагинациях плазматических мембран, где за счет белков переносчиков, осуществляющих Na/H обмен, создается кислая среда и начинается деградация гиалуроновой кислоты. Это так называемая гиалуроносома, которая предопределяет следующий за этим внутриклеточный этап, где под действием лизосомальной гиалуронидазы 1-го типа молекула полимера распадается до моносахаридов . Циркулирующая в крови гиалуронидаза также считается гиалуронидазой 1-го типа, активность которой проявляется в кислой среде. Увеличение концентрации натрия в сыворотке крови может активизировать процесс секреции ионов водорода посредством белков-переносчиков, осуществляющих Na+/Н+-обмен и влиять на скорость деградации гиалуроновой кислоты. Однако, как показывают результаты данного исследования, натрий в бесклеточной среде инкубации, где не может происходить формирования гиалуроносом, способен оказывать непосредственное регулирующее влияние на гиалуронидазную активность сыворотки крови, при низких концентрациях активируя фермент, а при высоких, наоборот, подавляя. Подтверждением этому высказыванию может быть тот факт, что аналогичный дозозависимый эффект на гиалуронидазную активность сыворотки крови был характерен и для ионов калия. По-видимому, калий, имея одинаковый заряд и сопоставимую массу, способен связываться с участками связывания натрия и имитировать его эффекты. Возможно, что такие участки связывания основных катионов крови могут быть не только на самой молекуле гиалуронидазы, но и на ингибиторах гиалуронидаз, циркулирующих в крови . В этом случае изменение активности сывороточной гиалуронидазы может осуществляться посредством изменения степени ингибирования фермента.
5. Заключение
Основные катионы сыворотки крови натрий и калий в бесклеточной среде инкубации могут оказывать регулирующее влияние на активность сывороточной гиалуронидазы крыс линии Вистар при низких концентрациях активируя фермент, а при высоких, наоборот, подавляя его активность.