1. Введение
Научные данные последних лет по исследованию обмена гиалуроновой кислоты (ГК) в организме человека демонстрируют её активную роль не только в реализации физиологических функций, но и в ряде патологических состояний, в связи с чем дальнейшее изучение свойств и обмена данной молекулы является актуальной задачей [1].
Гиалуроновая кислота является основным компонентом соединительной ткани млекопитающих и человека, представляющим собой линейный гетерополисахарид, размеры которого достигают 1-2 МДа [2], [3]. Синтез такой молекулы обеспечивается гиалуронансинтетазами различных клеток и сопровождается по мере элонгации цепи внутри клетки ее экстракцией во внеклеточное пространство, где она может подвергаться деградации под действием гиалуронидаз, главными из которых являются гиалуронидазы 1 и 2-го типов [4]. Считается, что степень деградации гиалуроновой кислоты существенно меняет физико-химические свойства межклеточного матрикса, а образующиеся продукты деградации могут проявлять самые разные регуляторные эффекты. Так, например, высокополимерная гиалуроновая кислота обладает антиангиогенными свойствами, в то время как продукты деградации гиалуроновой кислоты размером 20 кДа, которые образуются под действием гиалуронидазы 2-го типа, наоборот, являются ангиогенными [5].
Гиалуронидазная активность плазмы крови очень высокая в крови человека. Считается, что этот фермент-гиалуронидаза 1-го типа (ГИАЛ1) является лизосомальным ферментом и проявляет максимальную активность в кислой среде [6]. В сыворотке крыс также наблюдается максимальная гиалуронидазная активность по сравнению с печенью, почками, кожей и селезенкой [7]. Поскольку циркулирующая в крови Hyal-1 находится в неактивном состоянии, на сегодняшний день не ясно, какую роль может выполнять столь значительная активность этого фермента и каковы способы его активирования. Одним из возможных способов создания рН-оптимума фермента предполагается появление на поверхности клеток органов так называемой гиалуроносомы – углубления цитоплазматической мембраны, куда секретируются протоны за счет катионных мембранных белков-переносчиков [8]. В этой связи представляло интерес выяснить, как влияют главные катионы организма натрий и калий на гиалуронидазную активность сыворотки крови крыс.
Цель исследования — определить как изменяется гиалуронидазная активность сыворотки крови крыс в зависимости от концентрации ионов натрия и калия
2. Методы и принципы исследования
В экспериментах использовали самцов крыс линии Вистар массой 150-250 г, которые содержались на стандартной диете и свободном доступе к воде. После декапитирования кровь собирали, центрифугировали 5 минут при 600 g, отбирали сыворотку и использовали в экспериментах. Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами РФ и рекомендациям биоэтического комитета Института биомедицинских исследований Владикавказского Научного центра Российской академии наук.
Гиалуронидазную активность определяли флюориметрическим методом Моргана-Эльсона в модификации Т. Такахаши в условиях 3-х часового гидролиза при 37оС по конечному продукту N-ацетилглюкозамину [9]. Активность сопутствующих экзогидролаз ингибировали 0.02М слизевой кислотой, добавляемой в реакционную смесь. Флюоресценцию измеряли при волне возбуждения – 545 нм, эмиссии – 602 нм (Флюорат – 2М, ЛЮМЭКС, Санкт-Петербург, Россия). За единицу активности гиалуронидазы принимали количество фермента, необходимого в данных условиях реакции для образования 1 микромоля концевого глюкозамина за 1 мин.
Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони. Данные выражали как средние значения ± ошибка среднего (M±m).Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0,05.
3. Основные результаты
Влияние катионов натрия и калия на гиалуронидазную активность сыворотки крови крыс линии Вистар
На рисунке 1 представлено изменение гиалуронидазной активности сыворотки крови при добавлении ионов натрия и калия от 0 до 300 мМ (0, 20, 50, 100, 200 и 300 мМ). Как видно из рисунка, гиалуронидазная активность в отсутствие катионов была в районе 3,5 мЕ/мл. Однако с увеличением в среде инкубации концентрации как натрия, так и калия активность фермента возрастала и при концентрации катионов 50-100 мМ наблюдалось увеличение ферментативной активности в 1,5-2 раза. После чего дальнейшее увеличение концентрации обоих катионов приводило к снижению ферментативной активности, а при концентрации 300 мМ ферментативная активность практически подавлялась. Каких либо достоверных отличий по влиянию на гиалуронидазную активность ионов натрия по сравнению с ионами калия не было обнаружено. Графики обоих катионов практически совпадали, несмотря на тенденцию к небольшому росту гиалуронидазной активности в присутствии ионов натрия.
4. Обсуждение
Высокая гиалуронидазная активность сыворотки крови, очевидно, обеспечивает эффективный процесс деградации гиалуроновой кислоты в кровеносном русле. Известно, что гиалуроновая кислота поглощается клетками при участии таких мембранных рецепторов как CD44, которые в комплексе с гиалуронидазой 2-го типа располагаются в инвагинациях плазматических мембран, где за счет белков переносчиков, осуществляющих Na/H обмен, создается кислая среда и начинается деградация гиалуроновой кислоты. Это так называемая гиалуроносома, которая предопределяет следующий за этим внутриклеточный этап, где под действием лизосомальной гиалуронидазы 1-го типа молекула полимера распадается до моносахаридов [10]. Циркулирующая в крови гиалуронидаза также считается гиалуронидазой 1-го типа, активность которой проявляется в кислой среде. Увеличение концентрации натрия в сыворотке крови может активизировать процесс секреции ионов водорода посредством белков-переносчиков, осуществляющих Na+/Н+-обмен и влиять на скорость деградации гиалуроновой кислоты. Однако, как показывают результаты данного исследования, натрий в бесклеточной среде инкубации, где не может происходить формирования гиалуроносом, способен оказывать непосредственное регулирующее влияние на гиалуронидазную активность сыворотки крови, при низких концентрациях активируя фермент, а при высоких, наоборот, подавляя. Подтверждением этому высказыванию может быть тот факт, что аналогичный дозозависимый эффект на гиалуронидазную активность сыворотки крови был характерен и для ионов калия. По-видимому, калий, имея одинаковый заряд и сопоставимую массу, способен связываться с участками связывания натрия и имитировать его эффекты. Возможно, что такие участки связывания основных катионов крови могут быть не только на самой молекуле гиалуронидазы, но и на ингибиторах гиалуронидаз, циркулирующих в крови [8]. В этом случае изменение активности сывороточной гиалуронидазы может осуществляться посредством изменения степени ингибирования фермента.
5. Заключение
Основные катионы сыворотки крови натрий и калий в бесклеточной среде инкубации могут оказывать регулирующее влияние на активность сывороточной гиалуронидазы крыс линии Вистар при низких концентрациях активируя фермент, а при высоких, наоборот, подавляя его активность.