POSSIBILITIES OF USING DANIO RERIO (ZEBRAFISH) IN NEPHROLOGY: FROM MODELING TO THE ESTIMATION OF GLOMERULAR FILTRATION RATE

ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ DANIO RERIO (ZEBRAFISH) В НЕФРОЛОГИИ: ОТ МОДЕЛИ ДО ОЦЕНКИ СКОРОСТИ КЛУБОЧКОВОЙ ФИЛЬТРАЦИИ

Научная статья

Качанов Д.А.^1, *, Атангулов Г.И.², Салихов Х.Ф.³, Мамедов Н.Н.о.⁴, Умаров М.Д.⁵, Мухамедов Б.М.⁶, Кучерявенко М.Н.⁷, Громова В.С.⁸, Гамзатова Б.Н.⁹

¹ ORCID: 0000-0003-1528-1899;

^{1, 2, 6, 7, 8, 9} Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия;

^{3, 4, 5} Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого Минобрнауки России, Великий Новгород, Россия

* Корреспондирующий автор (Dmitrii.Kachanov[at]szgmu.ru)

Аннотация

В современной клинической практике для определения скорости клубочковой фильтрации существуют различные методы с применение как эндогенных, так и экзогенных маркеров фильтрации. У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. В данной статье рассматриваются возможности использования аквариумной рыбки Danio rerio (Zebrafish) в доклинических исследованиях в качестве модельного объекта при оценке скорости клубочковой фильтрации.

Ключевые слова: Danio rerio, Zebrafish, скорость клубочковой фильтрации, нефрология.

POSSIBILITIES OF USING DANIO RERIO (ZEBRAFISH) IN NEPHROLOGY: FROM MODELING TO THE ESTIMATION OF GLOMERULAR FILTRATION RATE

Research article

Kachanov D.A.^1, *, Atangulov G.I.², Salikhov Kh.F.³, Mamedov N.N.o.⁴, Umarov M.D.⁵, Mukhamedov B.M.⁶, Kucheryavenko M.N.⁷, Gromova V.S.⁸, Gamzatova B.N.⁹

¹ ORCID: 0000-0003-1528-1899;

^{1, 2, 6, 7, 8, 9} I.I. Mechnikov North-Western State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, St. Petersburg, Russia;

^{3, 4, 5} Yaroslav-the-Wise Novgorod State University of the Ministry of Education and Science of the Russian Federation, Veliky Novgorod, Russia

* Corresponding author (Dmitrii.Kachanov[at]szgmu.ru)

Abstract

In modern clinical practice, there are various methods for determining the glomerular filtration rate using both endogenous and exogenous filtration markers. Each method has its own advantages and disadvantages. The current study discusses the possibilities of using the aquarium fish Danio rerio (Zebrafish) in preclinical studies as a model organism for assessing the glomerular filtration rate.

Keywords: Danio rerio, Zebrafish, glomerular filtration rate, nephrology.

Актуальность

Определение скорости клубочковой фильтрации (СКФ) необходимо для оценки функционального состояния почек. В рутинной клинической практике в качестве показателя для оценки функции почек часто используется концентрация креатинина плазмы крови. Более точным показателем является СКФ. До 40% лиц со сниженной СКФ имеют уровень креатинина плазмы в пределах нормы. СКФ можно вычислять, используя эндогенные (инулин) и экзогенных маркеры фильтрации; рассчитывать по клиренсу эндогенных маркеров фильтрации или по формулам, основанным на сывороточном уровне эндогенных маркеров (креатинин, цистатин С) [1], [2]. Данные методы обеспечивают получение более точной информации и позволяют сделать выводы о функциональном состоянии фильтрационного барьера и реабсорбционной способности почек. Дефекты клубочкового барьера могут вызывать протеинурию, а также приводить к хронической болезни почек [1].

Цель исследования – изучить возможность использования биологического объекта – аквариумной рыбки Danio rerio (Zebrafish) в качестве модельного объекта при различных заболеваниях почек и оценке скорости клубочковой фильтрации. 

Материалы и методы

В данной работе проведен ретроспективный анализ данных зарубежных и отечественных работ (глубина исследования – 5 лет), посвященных использованию Danio rerio в доклинических исследованиях заболеваний почек.

Результаты и обсуждение

Лабораторные животные являются хорошим инструментом при проведении исследований новых лекарственных веществ. Danio rerio (Zebrafish) появился в качестве многообещающей новой экспериментальной модели для изучения различных заболеваний центральной нервной системы за счет своей высокой пропускной способности, генетического и физиологического сходства с человеком, низкой стоимости и быстрого репродуктивного цикла [1], [4], [5].

Danio rerio – это небольшая тропическая рыбка семейства карповых, обитающая в природе в прибрежных водах Индийского океана. По сравнению с другими модельными объектами, такими как плодовая мушка Drosophila melanogaster и червь Caenorhabditis elegance, между геном человека и рыбки Zebrafish установлена сильная консервативная связь [2], [5]. Это делает тропическую рыбку отличной моделью для изучения комплексных биологических процессов таких как развитие нервной, сердечно-сосудистой и гемопоэтической систем, а также ангиогенеза, апоптоза и токсических эффектов влияния различных факторов [5], [6]. Кроме того, есть ряд практических преимуществ, позволяющих эффективно поддерживать популяцию рыбок и надёжно регистрировать изменения, возникающие в эмбрионах и личинках [1], [7], [8]. Danio rerio легко разводится: в результате каждого спаривания можно получить до 200 икринок. Кроме того, развитие ex utero и оптическая прозрачность эмбрионов в процессе эмбриогенеза позволяет проводить визуальный анализ эмбрионов на разных стадиях развития и оценить органогенез [2], [5], [9]. К 24 часам после фертилизации уже начинает формироваться общий план строения тела и все клетки-прекурсоры и ткани мозга, глаза и сердце уже можно легко обнаружить с помощью рутинного светового микроскопа. Эмбриогенез завершается к 72 часам после фертилизации, а наиболее важные органы, включая кардиоваскулярную систему, желудочно-кишечный тракт, печень и почки, уже полностью формируются к 96 часам после оплодотворения. Считается, что такое стремительное развитие за 96 часов у Danio rerio соответствует трёхмесячному развитию человеческого эмбриона [5], [10]. К настоящему времени уже получены сотни генетических мутантов Danio rerio, фенотип которых напоминает и может быть клиническим эквивалентом заболеваний у человека. Также получено несколько химерных моделей с рецепторами и сигнальными молекулами человека. Гены, кодирующие определённые рецепторы и сигнальные молекулы, как правило, связаны с развитием кардиоваскулярной патологии, заболеваниями кроветворной, нервной систем, миопатиями и миодистрофиями, что позволяет анализировать эффективность перспективных лекарственных препаратов [2], [5], [9].

Ранее уже был изучен арсенал различных линий крыс и мышей с различными генетическими дефектами, приводящими к заболеваниям почек, в которых исследователи пытались понять механизмы патологии и более тщательно разработать подходы к оценке скорости клубочковой фильтрации [1], [3]. Однако, процесс использования у лабораторных животных различных веществ, таких как инулин или йогексол, является трудоемким и включает анестезию, забор крови и мочи с дальнейшим лабораторным анализом. Помимо этого, использование различных видов млекопитающих требует обоснованной этической экспертизы, а ограниченное финансирование может стать еще одним препятствием при планировании и разработке дизайна этих исследований [1].

Аквариумные рыбки Danio rerio (Zebrafish) на сегодняшний день представляют собой ведущий перспективный модельный объект для целого ряда исследований болезней человека. Патологические состояния, которые влияют на развитие и функционирование нефрона (гломерулонефрит, острое повреждение почек, поликистоз почек и др.), были успешно воссозданы и проанализированы на рыбках Danio rerio [1], [3]. Парный орган выделения у икринок Danio rerio – пронефрос – является полезным объектом для биомедицинских исследований, не только в течение 2-5 дней после оплодотворения, но и за пределами этого периода в связи со своей анатомической «простотой», связанной с наличием только двух нефронов, происходящих из одного больного клубочка, расположенного по средней линии эмбриона [1]. Клубочковая фильтрация начинается уже через 48 часов после оплодотворения, а полное созревание и избирательная фильтрационная способность клубочка происходит на 4 день после оплодотворения, когда подоциты и эндотелиальные клетки уже хорошо развиты [3]. Пронефротическая трубка разделена на отдельные сегменты: проксимальный и дистальный. Все эти особенности имеют общие структурные и функциональные сходства с нефронами других млекопитающих, включая почки человека, и именно это дает возможность использовать рыбок Danio rerio в качестве модельного объекта для изучения фильтрационной способности клубочков при различных заболеваниях, а также их регенеративных способностей [1], [3], [4].

Существует достаточно много мутантных линий рыбок Danio rerio, которые используются для изучения функций почек. Так, линия Tg(wtIb:EGFP) обеспечивает флуоресцентную визуализацию проксимальных канальцев и клубочков нефронов с помощью зеленого флуоресцентного белка и используется в оценке важности белка опухоли Вильмса (WT1) в нефрогенезе Danio rerio (развитии пронефроса и клубочков). Это схоже с его ролью в опухолеобразовании у человека, поскольку WT1 также играет ключевую роль в развитии почек у млекопитающих, а его мутации могут привезти к образованию нефробластомы (опухоли Вильмса) [1].

Учитывая важность мочевыделительной системы, наличие отека у мутантных Danio rerio может являться косвенным индикатором нарушения функции почек. Обязательной оговоркой данной модели является трудность обнаружения изменений в моче, оценке клиренса различных веществ, поскольку выделение у рыбок осуществляется в воду, а получить непосредственно чистую мочу не представляется возможным. Этот факт может ограничивать использование Danio rerio при моделировании различных заболеваний почек [1], [3], [4].

Исследования с флуоресцентными веществами дают возможность изучения скорости клубочковой фильтрации у рыбок Danio rerio. Флуоресцентные «индикаторы» вводят эмбрионам рыбок и прослеживают их прохождение в интересующей области под микроскопом [1], [3]. «Индикаторы» с большой молекулярной массой удерживаются неповрежденным почечным барьером и тем самым позволяют оценить функцию клубочка. Исследователями была разработана трансгенная линия для экспрессии витамин-Д-связывающего белка, помеченного зеленым флуоресцентным белком (VDBP-GFP). При скрещивании данной линии с другой, в которой может быть индуцировано повреждение подоцитов, «двойной» трансгенный эмбрион показывает накопление VDBP-GFP в проксимальных канальцах, что свидетельствует о повреждении барьера клубочковой фильтрации [3], [6], [7]. Кроме того, комплексное изучение скорости исчезновения низкомолекулярных флуоресцентных «индикаторов» у рыбок может использоваться в качестве приблизительного маркера скорости клубочковой фильтрации. Нарушение данной функции приведет к задержке «индикаторов», что можно визуализировать и измерить [1], [3], [4].

Выводы

Аквариумные рыбки Danio rerio представляют собой полезную модель для изучения функций и заболеваний почек. Патологические состояния, которые влияют на развитие и функционирование нефрона, успешно воссозданы и проанализированы на рыбках Danio rerio. А исследования с различными флуоресцентными веществами дают возможность изучения на них скорости клубочковой фильтрации.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Bachmann, S. From fish to nephrology: modeling glomerular function in Danio rerio larvae / Bachmann, Sebastian. // Acta physiologica (Oxford, England). 220. 10.1111/apha.12833.
2. Качанов Д.А. Сравнительный обзор возможностей использования Danio rerio (Zebrafish) в качества модельного объекта в доклинических исследованиях / Д.А. Качанов и др. // Уральский медицинский журнал. – 2020. - №7(190). – С. 158-162.
3. Outtandy, P. Zebrafish as a model for kidney function and disease / P. Outtandy, C. Russell, R. Kleta et al. // Pediatr Nephrol 34, 751–762 (2019).
4. Poureetezadi, S. J. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease / S. J. Poureetezadi, R. A. Wingert // Kidney International, 89(6), 1204–1210.doi:10.1016/j.kint.2016.01.031
5. Zarantoniello M. Zebrafish (Danio rerio) physiological and behavioural responses to insect-based diets: a multidisciplinary approach / M. Zarantoniello, B. Randazzo, G. Gioacchini et al. // Sci Rep 10, 10648 (2020).
6. Качанов Д.А. Danio rerio (Zebrafish) как универсальный модельный объект в доклинических исследованиях / Д.А. Качанов и др. // Forcipe. – 2018. - Т.1. - №1. – C. 49-54.
7. Hanke N. Fluorescence-Based Assay for Proteinuria Screening in Larval Zebrafish (Danio rerio) / N. Hanke, B.L. King, B. Vaske et al. // Zebrafish. 2015;12(5):372-376. doi:10.1089/zeb.2015.1093
8. Wang X. Evaluation of nephrotoxic effects of aristolochic acid on zebrafish (Danio rerio) larvae / X. Wang, K.C. Liu, G.J. Sun et al. // Hum Exp Toxicol. 2016 Sep;35(9):974-82. doi: 10.1177/0960327115613844. Epub 2015 Nov 26. PMID: 26612554.
9. Ribeiro S. Toxicity screening ofDiclofenac, Propranolol, Sertraline and Simvastatin using Danio rerio and Paracentrotus lividus embryo bioassays / Silvia Ribeiro, Tiago Torres, Rosario Martins et al. // Ecotoxicology and Environmental Safety. - 2015. - P. 67-74
10. Souza P. Toxicological effects of graphene oxide on adult zebrafish (Danio rerio) / J.P. Souzaet al. //Aquatic Toxicology. - V 186 - 2017. - P. 11-18.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Bachmann, S. From fish to nephrology: modeling glomerular function in Danio rerio larvae / Bachmann, Sebastian. // Acta physiologica (Oxford, England). 220. 10.1111/apha.12833.
2. Kachanov D. A. Sravnitel'nyj obzor vozmozhnostej ispol'zovanija Danio rerio (Zebrafish) v kachestva model'nogo ob#ekta v doklinicheskih issledovanijah [Comparative review of the possibilities of using Danio rerio (Zebrafish) as a model object in preclinical research] / D. A. Kachanov et al. // Ural'skij medicinskij zhurnal [Ural Medical Journal]. – 2020. - №7(190). – Pp. 158-162. [in Russian]
3. Outtandy, P. Zebrafish as a model for kidney function and disease / P. Outtandy, C. Russell, R. Kleta et al. // Pediatr Nephrol 34, 751–762 (2019).
4. Poureetezadi, S. J. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease / S. J. Poureetezadi, R. A. Wingert // Kidney International, 89(6), 1204–1210.doi:10.1016/j.kint.2016.01.031
5. Zarantoniello M. Zebrafish (Danio rerio) physiological and behavioural responses to insect-based diets: a multidisciplinary approach / M. Zarantoniello, B. Randazzo, G. Gioacchini et al. // Sci Rep 10, 10648 (2020).
6. Kachanov D. A. Danio rerio (Zebrafish) kak universal'nyj model'nyj ob#ekt v doklinicheskih issledovanijah [Danio rerio (Zebrafish) as a universal model object in preclinical research] / D. A. Kachanov et al.// Forcipe. - 2018. - Vol. 1. - No. 1. - P. 49-54. [in Russian]
7. Hanke N. Fluorescence-Based Assay for Proteinuria Screening in Larval Zebrafish (Danio rerio) / N. Hanke, B.L. King, B. Vaske et al. // Zebrafish. 2015;12(5):372-376. doi:10.1089/zeb.2015.1093
8. Wang X. Evaluation of nephrotoxic effects of aristolochic acid on zebrafish (Danio rerio) larvae / X. Wang, K.C. Liu, G.J. Sun et al. // Hum Exp Toxicol. 2016 Sep;35(9):974-82. doi: 10.1177/0960327115613844. Epub 2015 Nov 26. PMID: 26612554.
9. Ribeiro S. Toxicity screening ofDiclofenac, Propranolol, Sertraline and Simvastatin using Danio rerio and Paracentrotus lividus embryo bioassays / Silvia Ribeiro, Tiago Torres, Rosario Martins et al. // Ecotoxicology and Environmental Safety. - 2015. - P. 67-74
10. Souza P. Toxicological effects of graphene oxide on adult zebrafish (Danio rerio) / J.P. Souzaet al. //Aquatic Toxicology. - V 186 - 2017. - P. 11-18.