A GENOMIC SURVEY OF MULTIDRUG-RESISTANT SURGICAL PATHOGENS

Research article
DOI:
https://doi.org/10.23670/IRJ.2024.141.77
Issue: № 3 (141), 2024
Suggested:
27.02.2024
Accepted:
12.03.2024
Published:
18.03.2024
177
3
XML
PDF

Abstract

The application of molecular genetic methods in modern microbiology is promising for confirmation and detailing of the mechanism of antibacterial resistance in pathogens of surgical infections. Objective. To study the distribution of genetic determinants of resistance and pathogenicity of pathogens of surgical infections in the department of a multidisciplinary hospital. Materials and Methods. Microbiological and molecular-genetic study of isolated multidrug-resistant strains obtained from patients with surgical infections was carried out. Main Results. 37 strains of hospital microflora with high level of antibacterial resistance were isolated and identified, including A. baumanii – 14, K. pneumonia – 12, P. aeruginosa – 11. Whole-genome sequencing data revealed that multidrug-resistant K. pneumonia have sequencing types ST 395 and ST147. ST147 bacteria show evidence of convergence of antibiotic resistance and virulence properties. Multidrug-resistant strains of P. aeruginosa were represented by three sequencing types ST357, ST644, ST773. Multiresistant strains of A. baumannii were represented by three sequence types ST19, ST25, ST78. Conclusion. The use of full genome sequencing to identify genetic determinants of resistance and pathogenicity of bacteria plays an important role in the set of measures of epidemiological monitoring and optimization of antibiotic therapy tactics. K. pneumonia β-lactamase genes: blaTEM-150, blaNDM-1, blaCTX-M-15A, blaOXA-72; A. baumannii: blaCTX-M-115, blaOXA-48, blaOXA-64, blaOXA-69, blaOXA-72, blaCARB-14; P. aeruginosa: blaOXA-48, blaOXA-72, blaNDM-1, blaCTX-M-115 are the most important for the assessment of antibiotic resistance in the studied unit and can be recommended for detection by polymerase chain reaction to speed up the diagnostic process.

1. Введение

Наиболее частыми возбудителями нозокомиальных инфекций, нередко приводящих к развитию сепсиса, являются бактерии группы «ESKAPE» (E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumanii, P. aeruginosa, Enterobacter spp.), которые Всемирная организация здравоохранения отнесла к числу наиболее значимых патогенов, поскольку они обладают множеством факторов природной и приобретенной резистентности к антибиотикам

,
. В настоящее время большинство из этих микроорганизмов уже имеют устойчивость к нескольким антибактериальным препаратам, а внутрибольничные штаммы зачастую характеризуются множественной лекарственной устойчивостью. Это значительно осложняет проведение антибактериальной терапии, для эффективности, которой необходимо знание результатов фенотипического определения минимальных подавляющих концентраций. Но на определение этого требуется много времени и первое назначение антибиотиков проводится, как правило, исходя из знаний эпидемиологической обстановки в отделении и данных анамнеза. Такой эмпирический подход может привести к непопаданию в профиль чувствительности патогена, укреплению его резистентности и утяжелению течения инфекционного процесса. Для ускорения получения информации о профиле устойчивости возбудителя существует возможность воспользоваться тестами полимеразной цепной реакции для выявления генов резистентности как в чистой культуре, так и в первичном материале. Для выявления наиболее значимых генетических детерминант необходимо проводить генетический мониторинг факторов резистентности и вирулентности возбудителей в медицинском учреждении, который позволит еще и более пристально проводить противоэпидемические мероприятия для борьбы с распространением антибактериальной резистентности инфекции, связанной с оказанием медицинской помощи
.

Цель исследования – исследовать распространение генетических детерминант антибактериальной резистентности и патогенности возбудителей абдоминальных хирургических инфекций в хирургическом отделении многопрофильного стационара.

2. Методы и принципы исследования

Проведено микробиологическое и молекулярно-генетическое исследование 37 образцов биоматериала, отобранного из раневого содержимого у пациентов с хирургическими инфекциями, проходивших лечение в специализированном хирургическом стационаре Санкт-Петербурга. Видовую идентификацию выросших на первичных посевах микроорганизмов проводили методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией / ионизацией с использованием прибора BactoSCREEN («Литех», Россия). Определение устойчивости штаммов к антибактериальным препаратам проводили диско-диффузионным методом на среде Мюллера-Хинтон. Результаты устойчивости к карбапенемам, фторхинолонам, аминогликозидам, учитывали в соответствии с рекомендациями «European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters Version 12.0», а устойчивость к цефалоспоринам, пенициллинам, тетрациклинам определяли в соответствии с критериями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 2020).

Выделенные микроорганизмы со множественной лекарственной устойчивостью были представлены штаммами: A. baumanii (14 штаммов), K. pneumonia (12 штаммов) и P. aeruginosa (11 штаммов). Из всех штаммов была выделена геномная ДНК при помощи набора «МагноПрайм ЮНИ» (НекстБио, Россия) по инструкции производителя. Концентрацию ДНК измеряли на флуориметре Qubit 2.0 (LifeTechnologies, США) и набора реагентов «QuDyedsDNA» HS (Lumiprobe, Германия). Полногеномное секвенирование проводили на платформе «MiSeq» с использованием набора реагентов v3 с парными считываниями 2х150 п.н. (Illumina, США). Библиотеки были подготовлены согласно руководству «Proxima-D» (Диасистемс, Россия). Полученные единичные прочтения для каждого штамма были собраны в контиги при помощи программы «Unicyclerv.0.4.7». Образцы с величиной средних покрытий геномов выше 100 свидетельствовали о достаточном объеме данных для обработки и реконструкции генома микроорганизма с помощью программы анализа метагеномных данных «KrakenMetagenomics 2». Филогенетический анализ проводили с помощью программного продукта «Wombac 2.0», выявляя SNP полиморфизмы в наиболее значимых участках генома бактерии. Мультиплексное сиквенс-типирование проводили с использованием сервера MLTS 2.0 и программы «Lasergene» по генам: gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB, tonB.

3. Основные результаты

Для исследования генетических детерминант устойчивости выбраны штаммы, проявившие высокую степень антибактериальной резистентности. В результате фенотипической оценки было установлено, что выделенные штаммы K. pneumoniae устойчивы к фторхинолонам II поколения (ципрофлоксацин), фторхинолонам III поколения (левофлоксацин), цефалоспоринам III поколения (цефтазидим, цефотаксим), аминогликозидам II поколения (гентамицин, тобрамицин), защищенным пенициллинам (тикарциклин-клавулонат, пиперациллин-тазобактам, амоксиклав), карбапенемам (меропенем, имипенем).

Штаммы P. aeruginosa оказались резистентными к фторхинолонам II поколения (ципрофлоксацин), фторхинолонам III поколения (левофлоксацин), цефалоспоринам III поколения (цефтазидим), цефалоспоринам IV поколения (цефепим), к полипептидам (колистин), аминогликозидам II поколения (гентамицин, тобрамицин), III поколения (амикацин), защищенным пенициллинам (ампициллин-сульбактам, тикарциклин-клавулонат, пиперациллин-тазобактам), карбапенемам (меропенем, имипенем).

Штаммы A. baumanii оказались резистентными к фторхинолонам II поколения (ципрофлоксацин), фторхинолонам III поколения (левофлоксацин), цефалоспоринам III поколения (цефтазидим), цефалоспоринам IV поколения (цефепим), к полипептидам (колистин), аминогликозидам II поколения (гентамицин, тобрамицин), аминогликозидам III поколения (амикацин), защищенным пенициллинам (ампициллин-сульбактам,), карбапенемам (меропенем, имипенем).

Полногеномное секвенирование выбранных штаммов госпитальной микрофлоры позволило установить, что наиболее резистентные штаммы K. pneumoniae представлены двумя сиквенс типами ST147 и ST395 (табл. 1). Оба штамма имели широкий набор генов резистентности и патогенности. Так K. pneumoniae ST147 имела 2 гена β-лактамаз широкого спектра класса А blaTEM-150, blaSHV-11. Также выявлен ген β-лактамаз широкого спектра относящийся к функциональной группе 2be blaCTX-M-15, два гена β-лактамаз класса D устойчивых к ингибиторам функциональной группы 2d blaOXA-1, blaOXA-9 и ген металло β-лактамазы blaNDM-1 и ген карбапенемазы OXA-48, придающие устойчивость микробу к карбапенемам. Кроме того, выявлены 2 гена ферментов, модифицирующих аминогликозиды aac(6')-Ib-AKT, aadA1. Выявлены гены устойчивости к хлорамфениколу catA1, catB3. Ген fosA – глютатион S-трансферазы, определяющий устойчивость к фосфомицину. Гены мембранных белков мультилекарственной устойчивости за счет активации эффлюкса oqxA6, oqxB19. Ген устойчивости к фторхинолонам qnrS1, рифампицину arr-3 и сульфаниламидам sul1.

Второй выявленный штамм K. pneumoniae ST395 обладал множественной лекарственной устойчивостью за счет 8 генов β-лактамаз широкого спектра класса А blaTEM-150, гена blaSHV-158. Так же выявлен ген β-лактамаз расширенного спектра относящийся к функциональной группе 2be blaCTX-M-15, ген β-лактамаз класса D, устойчивых к ингибиторам, функциональной группы 2d blaOXA-1 и ген металло β-лактамазы blaNDM-1, а так же ген карбапенемазы OXA-48. Набор генов резистентности к другим антибиотикам был схож со штаммом ST395. Так, были выявлены 2 гена ферментов, модифицирующих аминогликозиды aph(3')-VI, aac(6')-Ib-D181Y. Выявлен ген устойчивости к хлорамфениколу catA1. Ген fosA – глютатион S-трансферазы, определяющий устойчивость к фосфомицину. Гены мембранных белков мультилекарственной устойчивости за счет активации эффлюкса oqxA6, oqxB. Ген устойчивости к фторхинолонам qnrS1, сульфаниламидам sul1, тетрациклину tet(A).

Штаммы выделенных сиквенс типов демонстрировали наличие биомаркера вирулентности – генов iuc A, B, C (аэробактин), бактерии ST147 дополнительно имели гены ybtP, ybtQ (из острова высокой патогенности иерсиний), что позволяет прогнозировать фенотипы гипервирулентности.

Таблица 1 - Результаты секвенирования штаммов K. pneumoniae

Сиквенс тип

Гены резистентности

Гены вирулентности

к аминогликозидам

к β-лактамам

к карбапенемам

к другим препаратам

ST147

aac(6')-Ib-AKT

aadA1

blaOXA-1

blaOXA-9

blaSHV-11

blaTEM-150

blaNDM-1

blaCTX-M-15

blaOXA-48

catA1

catB3

fosA_gen

oqxA6

oqxB19

qnrS1

arr-3

sul1

iucA, iucB, iucC, iutA, ybtP, ybtQ

ST395

aph(3')-VI

aac(6')-Ib-D181Y

blaOXA-1

blaSHV-158

blaTEM-122

blaTEM-135

blaTEM-141

blaTEM-1В

blaTEM-1С

blaTEM-29

blaTEM-55

blaTEM-57

blaNDM-1

blaCTX-M-15

blaOXA-48

catA1

fosA_gen

mph(A)

oqxA

oqxB

qnrS1

sul1

tet(A)

dfrA1

iucA, iucB, iucC, iutA

A. baumannii является одним из самых приоритетных внутрибольничных патогенов во всем мире, поскольку обладает многими конститутивными факторами устойчивости и способен легко принимать R-плазмиды от бактерий других видов. В нашем случае штаммы A. baumannii, обладающие мультирезистентностью, были представлены тремя сиквенс типами ST19, ST25, ST78 (табл. 2). Все штаммы имели гены β-лактамаз blaADC (26, 152, 185) и bla GES-12. Так же выявлены гены β-лактамаз класса D устойчивых к ингибиторам функциональной группы 2d blaOXA-14, blaOXA-48, blaOXA-64, blaOXA-69, blaOXA-72, blaOXA-90. Обращает на себя внимание ST78, который дополнительно обладал генами blaCTX-M115 и blaCARB-14. У всех выделенных штаммов были гены ферментов, модифицирующих аминогликозиды aac(6')-Ib-AKT, ant(2'')-Ia, ant(3'')-IIa, aadA2. Штамм ST78 имел ген высокой устойчивости к аминогликозидам armA. Штаммы ST19 и ST78 имели ген устойчивости к хлорамфениколу catA1, причем у штамма ST19 эта устойчивость была связана еще и с наличием гена cmlA1. Штамм ST78 дополнительно имел ген устойчивости к хлорамфениколу floR. Все штаммы A. baumannii имели гены устойчивости к сульфаниламидам sul1, возбудители ST19 и ST25 дополнительно имели гены sul2, dfrA7. Штамм ST19 был устойчив к макролидам за счет гена tet(B), ST78 имел гены резистентности mphE и msrE.

Таблица 2 - Результаты секвенирования штаммов A. baumannii

Сиквенс тип

Гены антибактериальной резистентности

к аминогликозидам

к β-лактамазам

к карбапенемазам

к другим препаратам

ST19

aph(3')-VIa

aac(6')-Ib-AKT

ant(2'')-Ia

ant(3'')-IIa

aadA2

aph(3'')-Ib

aph(6)-Id

blaADC-185

blaGES-12

blaOXA-69

blaOXA-72

catA1

cmlA1

sul1

sul2

tet(B)

dfrA7

ST78

aac(6')-Ian

aac(6')-Ib-AKT

ant(2'')-Ia

ant(3'')-IIa

aadA2

aadA5

blaADC-152

blaCTX-M-115

blaGES-12

blaCARB-14

blaOXA-72

blaOXA-90

catA1

floR

armA

mph(E)

msr(E)

sul1

ST25

aac(6')-Ib-AKT

ant(2'')-Ia

aph(3')-Ia

ant(3'')-IIa

aadA1

aph(3'')-Ib

aph(6)-Id

blaADC-26

blaGES-12

blaOXA-48

blaOXA-64

blaOXA-72

sul1

sul2

dfrA7

Мультирезистентные штаммы P. aeruginosa были представлены тремя сиквенс типами ST357, ST644, ST773 (табл. 3). Все штаммы микроорганизмов имели широкий набор генов резистентности. Так, P. aeruginosa ST357 имеет 3 гена β-лактамаз широкого спектра класса blaOXA846, blaPDC374. Так же выявлены гены β-лактамаз расширенного спектра blaVEB14 и ген металло β-лактамазы blaNDM-1, гены карбапенемаз OXA-48, OXA-78 придающие устойчивость микробу к карбапенемам. Кроме того, выявлены 7 генов ферментов, модифицирующих аминогликозиды группы aac(6'), ant(2), apf(3), rmtB4, aadA1. Выявлены гены устойчивости к хлорамфениколу catB7. Ген fosA – глютатион S-трансферазы, определяющий устойчивость к фосфомицину. Ген устойчивости к фторхинолонам crpP, хлорамфениколу catB7, сульфаниламидам sul1, sul2, dfrB2 и макролидам tet(A).

P. aeruginosa ST644 по спектру генов резистентности была схожа с ST357 и имела 3 гена β-лактамаз широкого спектра класса blaOXA846, blaPDC374. Также выявлены гены β-лактамаз расширенного спектра blaVEB14 гены карбапенемаз OXA-48, OXA-78 придающие устойчивость микробу к карбапенемам, но вместо blaNDM-1 имела bla CTX-M115. Кроме того, выявлены 3 гена ферментов, модифицирующих аминогликозиды группы aac(6'), apf(3), aadA1. Выявлены гены устойчивости к хлорамфениколу catB7. Ген fosA – глютатион S-трансферазы, определяющий устойчивость к фосфомицину. Ген устойчивости к фторхинолонам crpP, хлорамфениколу catB7, сульфаниламидам sul1, гены эффлюкса ogxA9, aqxB5.

Третий обнаруженный сиквенс тип ST773 имел ген β-лактамаз широкого спектра класса blaOXA-395, blaPDC-385. Так же выявлены гены β-лактамаз расширенного спектра blaPAO. Генов карбапенемаз OXA-48, OXA-78 придающие устойчивость микробу к карбапенемам не обнаружено, однако есть ген металлолактамазы blaNDM-1. Кроме того, выявлены 5 генов ферментов, модифицирующих аминогликозиды группы aac(6'), apf(3), aadA6, rmtB4. Выявлены гены устойчивости к хлорамфениколу catB7. Ген fosA – глютатион S-трансферазы, определяющий устойчивость к фосфомицину. Ген устойчивости к хлорамфениколу catB7, сульфаниламидам sul1.

Таблица 3 - Результаты секвенирования штаммов P. aeruginosa

Сиквенс тип

Гены антибактериальной резистентности

к аминогликозидам

к β-лактамам

к карбапенемам

к другим препаратам

ST357

aac(6')-Ian

aac(6')-Ib-AKT

aac(6')-Il

rmtB4

ant(2'')-Ia

aph(3')-IIb

aadA1

blaOXA-846

blaNDM-1

blaPDC-374

blaVEB-14

blaOXA-48

blaOXA-72

catB7

floR2

crpP

fosA-354827590

sul1

sul2

tet(A)

dfrB2

ST644

aac(6')-Ian

aph(3')-IIb

aadA1

blaOXA-486

blaACT-15

blaCTX-M-115

blaPDC-374

blaOXA-48

blaOXA-72

catB7

floR

crpP

fosA

fosA-354827590

oqxA9

oqxB5

sul1

ST773

aac(6')-Ib-cr4

aac(6')-Ian

rmtB4

aph(3')-IIb

aadA6

blaOXA-395

blaNDM-1

blaPDC-385

blaPAO

catB7

floR2

fosA-354827590

sul1

4. Обсуждение

Международные клональные линии высокого риска полирезистентных и гипервирулентных штаммов K. pneumoniae связанных с внутрибольничными инфекциями представлены в основном сиквенс-типами ST11, ST147, ST258, ST307, ST395. В наших исследованиях мы выделили два сиквенс типа ST147 и ST395. Похожую ситуацию описывали авторы в 2017 году во Франции

, когда из 36 изолятов K. pneumoniae имеющих устойчивость к фторхинолонам и карбапенемам самыми распространенными были ST147 ST395. Кроме множественной резистентности эти штаммы не показывали увеличения вирулентности. Не так давно была описана K. pneumoniae ST147, выделенная от двух пациентов в Канаде и Турции
,
. Генетический профиль устойчивости и патогенности был схожим с описанным нами. Штамм был устойчив к карбапенемам, β-лактамам, цефтазидим-авибактаму и макролидам, но оставался чувствительным к аминогликозидам и тигециклину. При этом выделенный штамм демонстрировал значительно более низкую скорость образования биопленок, а значит, имел низкую вирулентность. В нашем исследовании K. pneumoniae ST147 демонстрировали высокий уровень устойчивости и к аминогликозидам, а наличие целого спектра генов вирулентности свидетельствует о более высоком патогенном потенциале выделенных штаммов. Выделенный нами штамм K. pneumoniae ST147 свидетельствует о конвергенции свойств вирулентности и антибактериальной резистентности, что является опасным и требует пристального внимания.

Штамм K. pneumoniae ST395 выделенный нами также проявлял фенотипические и генотипические признаки множественной лекарственной устойчивости, а по набору генов вирулентности уступал ST147, выявлялись только гены аэробактина, что может говорить о достаточно высокой или, во всяком случае, не сниженной вирулентности.

Способность A. baumannii приобретать устойчивость делает его одним из наиболее важных внутрибольничных патогенов во всем мире. В нашем случае из трех выделенных штаммов A. baumannii ST78 обладал наибольшей мультирезистентностью за счет 7 генов устойчивости к аминогликозидам, 6 генов β-лактамаз групп OXA, CTX-M, CARB и 5 генов устойчивости к другим антибактериальным препаратам (хлорамфеникол, макролиды, сульфаниламиды). Описаны два подобных изолята A. baumannii ST78, которые были выделены у одного пациента в июле 2012 года в больнице в Гессене, и у второго пациента в сентябре 2013 года в Баварии, причем оба пациента ранее были госпитализированы в Москве после тяжелых дорожно-транспортных происшествий

. Авторы делают вывод, что этот сиквенс тип имеет высокое распространение и множественную лекарственную устойчивость за счет большого количества перекрестно работающих ферментов, некоторые из которых можно обнаружить только молекулярно-генетическими методами. Если этого не делать, то создаются условия для распространения антибактериальной резистентности.

Выявленные нами штаммы P. aeruginosa являются представителями широко распространенных линий синегнойной палочки, обладающей множественной устойчивостью. Так, P. aeruginosa ST 357 с аналогичным спектром генов резистентности была обнаружена в 2023 году в Бангладеш

. P. aeruginosa ST 773 высоко устойчивая к цефалоспоринам и карбапенемам и широким спектром генов резистентности к другим антибиотикам была обнаружена в 2023 году в Южной Корее
. P. aeruginosa ST 644 с множественной антибактериальной резистентностью выявлена в 2018 году у магеллановых пингвинов
.

Можно заключить, что наиболее важными с точки зрения назначения антибактериальной терапии современными β-лактамами, карбапенемами, эпидемиологического мониторинга и выявления резистентности с помощью полимеразной цепной реакции в обследованном отделении являются для K. pneumonia гены резистентности blaTEM-150, blaNDM-1, blaCTX-M-15A, blaOXA-72; для A. baumannii гены резистентности blaCTX-M-115, blaOXA-48, blaOXA-64, blaOXA-69, blaOXA-72, blaCARB-14; для P. aeruginosa гены резистентности blaOXA-48, blaOXA-72, blaNDM-1, blaCTX-M-115.

5. Заключение

Одной из наиболее важных проблем, возникающих из-за устойчивости к противомикробным препаратам, является ее выявление и принятие правильного решения об адекватной терапии у пациентов. b-лактамазы расширенного спектра и карбапенемазы относятся к детерминантам резистентности, распространение которых представляет наибольшую угрозу целой группе антибактериальных препаратов – цефалоспоринам различных поколений и карбапенемам. В настоящее время критерии «CLSI 2020» не рекомендуют какой-либо конкретный подтверждающий фенотипический тест для определения механизмов резистентности, это решает каждая микробиологическая лаборатория самостоятельно. В оптимальной стратегии борьбы с антибактериальной устойчивости необходимо отслеживание фенотипов резистентности клинических изолятов, сбор сведений о генах, приводящих к определенному фенотипу и оценка их значимости. К сожалению, ни один из традиционных фенотипических микробиологических методов не обеспечивают детекции всех механизмов резистентности. Эта проблема обостряется, поскольку все чаще встречаются наличие у бактерий нескольких детерминант устойчивости одновременно. В этих условиях полногеномное секвенирование помогает выявлять широкий диапазон детерминант антибактериальной устойчивости. Применение его в качестве способа генетического надзора за изменениями в спектре генов резистентности позволяет определить мишени для применения полимеразной цепной реакции, с помощью которой можно быстро и точно выявить соответствующие детерминанты и принять обоснованное решение о начальной антибактериальной терапии у каждого пациента.

В некоторых случаях молекулярно-генетические методы позволяют идентифицировать проблемные возбудители и детерминанты антибактериальной резистентности в клиническом материале даже без выделения их в чистой бактериологической культуре, что существенно ускоряет оценку клинически значимых свойств микроорганизма. Поэтому представляется перспективным проведение регулярного микробиологического мониторинга инфекции, связанной с оказанием медицинской помощи методам полногеномного секвенирования.

Article metrics

Views:177
Downloads:3
Views
Total:
Views:177