A GENOMIC SURVEY OF MULTIDRUG-RESISTANT SURGICAL PATHOGENS

Наиболее частыми возбудителями нозокомиальных инфекций, нередко приводящих к развитию сепсиса, являются бактерии группы «ESKAPE» (E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumanii, P. aeruginosa, Enterobacter spp.), которые Всемирная организация здравоохранения отнесла к числу наиболее значимых патогенов, поскольку они обладают множеством факторов природной и приобретенной резистентности к антибиотикам

Цель исследования – исследовать распространение генетических детерминант антибактериальной резистентности и патогенности возбудителей абдоминальных хирургических инфекций в хирургическом отделении многопрофильного стационара.

Проведено микробиологическое и молекулярно-генетическое исследование 37 образцов биоматериала, отобранного из раневого содержимого у пациентов с хирургическими инфекциями, проходивших лечение в специализированном хирургическом стационаре Санкт-Петербурга. Видовую идентификацию выросших на первичных посевах микроорганизмов проводили методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией / ионизацией с использованием прибора BactoSCREEN («Литех», Россия). Определение устойчивости штаммов к антибактериальным препаратам проводили диско-диффузионным методом на среде Мюллера-Хинтон. Результаты устойчивости к карбапенемам, фторхинолонам, аминогликозидам, учитывали в соответствии с рекомендациями «European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters Version 12.0», а устойчивость к цефалоспоринам, пенициллинам, тетрациклинам определяли в соответствии с критериями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 2020).

Выделенные микроорганизмы со множественной лекарственной устойчивостью были представлены штаммами: A. baumanii (14 штаммов), K. pneumonia (12 штаммов) и P. aeruginosa (11 штаммов). Из всех штаммов была выделена геномная ДНК при помощи набора «МагноПрайм ЮНИ» (НекстБио, Россия) по инструкции производителя. Концентрацию ДНК измеряли на флуориметре Qubit 2.0 (LifeTechnologies, США) и набора реагентов «QuDyedsDNA» HS (Lumiprobe, Германия). Полногеномное секвенирование проводили на платформе «MiSeq» с использованием набора реагентов v3 с парными считываниями 2х150 п.н. (Illumina, США). Библиотеки были подготовлены согласно руководству «Proxima-D» (Диасистемс, Россия). Полученные единичные прочтения для каждого штамма были собраны в контиги при помощи программы «Unicyclerv.0.4.7». Образцы с величиной средних покрытий геномов выше 100 свидетельствовали о достаточном объеме данных для обработки и реконструкции генома микроорганизма с помощью программы анализа метагеномных данных «KrakenMetagenomics 2». Филогенетический анализ проводили с помощью программного продукта «Wombac 2.0», выявляя SNP полиморфизмы в наиболее значимых участках генома бактерии. Мультиплексное сиквенс-типирование проводили с использованием сервера MLTS 2.0 и программы «Lasergene» по генам: gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB, tonB.

Для исследования генетических детерминант устойчивости выбраны штаммы, проявившие высокую степень антибактериальной резистентности. В результате фенотипической оценки было установлено, что выделенные штаммы K. pneumoniae устойчивы к фторхинолонам II поколения (ципрофлоксацин), фторхинолонам III поколения (левофлоксацин), цефалоспоринам III поколения (цефтазидим, цефотаксим), аминогликозидам II поколения (гентамицин, тобрамицин), защищенным пенициллинам (тикарциклин-клавулонат, пиперациллин-тазобактам, амоксиклав), карбапенемам (меропенем, имипенем).

Штаммы P. aeruginosa оказались резистентными к фторхинолонам II поколения (ципрофлоксацин), фторхинолонам III поколения (левофлоксацин), цефалоспоринам III поколения (цефтазидим), цефалоспоринам IV поколения (цефепим), к полипептидам (колистин), аминогликозидам II поколения (гентамицин, тобрамицин), III поколения (амикацин), защищенным пенициллинам (ампициллин-сульбактам, тикарциклин-клавулонат, пиперациллин-тазобактам), карбапенемам (меропенем, имипенем).

Штаммы A. baumanii оказались резистентными к фторхинолонам II поколения (ципрофлоксацин), фторхинолонам III поколения (левофлоксацин), цефалоспоринам III поколения (цефтазидим), цефалоспоринам IV поколения (цефепим), к полипептидам (колистин), аминогликозидам II поколения (гентамицин, тобрамицин), аминогликозидам III поколения (амикацин), защищенным пенициллинам (ампициллин-сульбактам,), карбапенемам (меропенем, имипенем).

Полногеномное секвенирование выбранных штаммов госпитальной микрофлоры позволило установить, что наиболее резистентные штаммы K. pneumoniae представлены двумя сиквенс типами ST147 и ST395 (табл. 1). Оба штамма имели широкий набор генов резистентности и патогенности. Так K. pneumoniae ST147 имела 2 гена β-лактамаз широкого спектра класса А blaTEM-150, blaSHV-11. Также выявлен ген β-лактамаз широкого спектра относящийся к функциональной группе 2be blaCTX-M-15, два гена β-лактамаз класса D устойчивых к ингибиторам функциональной группы 2d blaOXA-1, blaOXA-9 и ген металло β-лактамазы blaNDM-1 и ген карбапенемазы OXA-48, придающие устойчивость микробу к карбапенемам. Кроме того, выявлены 2 гена ферментов, модифицирующих аминогликозиды aac(6')-Ib-AKT, aadA1. Выявлены гены устойчивости к хлорамфениколу catA1, catB3. Ген fosA – глютатион S-трансферазы, определяющий устойчивость к фосфомицину. Гены мембранных белков мультилекарственной устойчивости за счет активации эффлюкса oqxA6, oqxB19. Ген устойчивости к фторхинолонам qnrS1, рифампицину arr-3 и сульфаниламидам sul1.

Второй выявленный штамм K. pneumoniae ST395 обладал множественной лекарственной устойчивостью за счет 8 генов β-лактамаз широкого спектра класса А blaTEM-150, гена blaSHV-158. Так же выявлен ген β-лактамаз расширенного спектра относящийся к функциональной группе 2be blaCTX-M-15, ген β-лактамаз класса D, устойчивых к ингибиторам, функциональной группы 2d blaOXA-1 и ген металло β-лактамазы blaNDM-1, а так же ген карбапенемазы OXA-48. Набор генов резистентности к другим антибиотикам был схож со штаммом ST395. Так, были выявлены 2 гена ферментов, модифицирующих аминогликозиды aph(3')-VI, aac(6')-Ib-D181Y. Выявлен ген устойчивости к хлорамфениколу catA1. Ген fosA – глютатион S-трансферазы, определяющий устойчивость к фосфомицину. Гены мембранных белков мультилекарственной устойчивости за счет активации эффлюкса oqxA6, oqxB. Ген устойчивости к фторхинолонам qnrS1, сульфаниламидам sul1, тетрациклину tet(A).

Штаммы выделенных сиквенс типов демонстрировали наличие биомаркера вирулентности – генов iuc A, B, C (аэробактин), бактерии ST147 дополнительно имели гены ybtP, ybtQ (из острова высокой патогенности иерсиний), что позволяет прогнозировать фенотипы гипервирулентности.

A. baumannii является одним из самых приоритетных внутрибольничных патогенов во всем мире, поскольку обладает многими конститутивными факторами устойчивости и способен легко принимать R-плазмиды от бактерий других видов. В нашем случае штаммы A. baumannii, обладающие мультирезистентностью, были представлены тремя сиквенс типами ST19, ST25, ST78 (табл. 2). Все штаммы имели гены β-лактамаз blaADC (26, 152, 185) и bla GES-12. Так же выявлены гены β-лактамаз класса D устойчивых к ингибиторам функциональной группы 2d blaOXA-14, blaOXA-48, blaOXA-64, blaOXA-69, blaOXA-72, blaOXA-90. Обращает на себя внимание ST78, который дополнительно обладал генами blaCTX-M115 и blaCARB-14. У всех выделенных штаммов были гены ферментов, модифицирующих аминогликозиды aac(6')-Ib-AKT, ant(2'')-Ia, ant(3'')-IIa, aadA2. Штамм ST78 имел ген высокой устойчивости к аминогликозидам armA. Штаммы ST19 и ST78 имели ген устойчивости к хлорамфениколу catA1, причем у штамма ST19 эта устойчивость была связана еще и с наличием гена cmlA1. Штамм ST78 дополнительно имел ген устойчивости к хлорамфениколу floR. Все штаммы A. baumannii имели гены устойчивости к сульфаниламидам sul1, возбудители ST19 и ST25 дополнительно имели гены sul2, dfrA7. Штамм ST19 был устойчив к макролидам за счет гена tet(B), ST78 имел гены резистентности mphE и msrE.

Мультирезистентные штаммы P. aeruginosa были представлены тремя сиквенс типами ST357, ST644, ST773 (табл. 3). Все штаммы микроорганизмов имели широкий набор генов резистентности. Так, P. aeruginosa ST357 имеет 3 гена β-лактамаз широкого спектра класса blaOXA846, blaPDC374. Так же выявлены гены β-лактамаз расширенного спектра blaVEB14 и ген металло β-лактамазы blaNDM-1, гены карбапенемаз OXA-48, OXA-78 придающие устойчивость микробу к карбапенемам. Кроме того, выявлены 7 генов ферментов, модифицирующих аминогликозиды группы aac(6'), ant(2), apf(3), rmtB4, aadA1. Выявлены гены устойчивости к хлорамфениколу catB7. Ген fosA – глютатион S-трансферазы, определяющий устойчивость к фосфомицину. Ген устойчивости к фторхинолонам crpP, хлорамфениколу catB7, сульфаниламидам sul1, sul2, dfrB2 и макролидам tet(A).

P. aeruginosa ST644 по спектру генов резистентности была схожа с ST357 и имела 3 гена β-лактамаз широкого спектра класса blaOXA846, blaPDC374. Также выявлены гены β-лактамаз расширенного спектра blaVEB14 гены карбапенемаз OXA-48, OXA-78 придающие устойчивость микробу к карбапенемам, но вместо blaNDM-1 имела bla CTX-M115. Кроме того, выявлены 3 гена ферментов, модифицирующих аминогликозиды группы aac(6'), apf(3), aadA1. Выявлены гены устойчивости к хлорамфениколу catB7. Ген fosA – глютатион S-трансферазы, определяющий устойчивость к фосфомицину. Ген устойчивости к фторхинолонам crpP, хлорамфениколу catB7, сульфаниламидам sul1, гены эффлюкса ogxA9, aqxB5.

Третий обнаруженный сиквенс тип ST773 имел ген β-лактамаз широкого спектра класса blaOXA-395, blaPDC-385. Так же выявлены гены β-лактамаз расширенного спектра blaPAO. Генов карбапенемаз OXA-48, OXA-78 придающие устойчивость микробу к карбапенемам не обнаружено, однако есть ген металлолактамазы blaNDM-1. Кроме того, выявлены 5 генов ферментов, модифицирующих аминогликозиды группы aac(6'), apf(3), aadA6, rmtB4. Выявлены гены устойчивости к хлорамфениколу catB7. Ген fosA – глютатион S-трансферазы, определяющий устойчивость к фосфомицину. Ген устойчивости к хлорамфениколу catB7, сульфаниламидам sul1.

Международные клональные линии высокого риска полирезистентных и гипервирулентных штаммов K. pneumoniae связанных с внутрибольничными инфекциями представлены в основном сиквенс-типами ST11, ST147, ST258, ST307, ST395. В наших исследованиях мы выделили два сиквенс типа ST147 и ST395. Похожую ситуацию описывали авторы в 2017 году во Франции

Штамм K. pneumoniae ST395 выделенный нами также проявлял фенотипические и генотипические признаки множественной лекарственной устойчивости, а по набору генов вирулентности уступал ST147, выявлялись только гены аэробактина, что может говорить о достаточно высокой или, во всяком случае, не сниженной вирулентности.

Способность A. baumannii приобретать устойчивость делает его одним из наиболее важных внутрибольничных патогенов во всем мире. В нашем случае из трех выделенных штаммов A. baumannii ST78 обладал наибольшей мультирезистентностью за счет 7 генов устойчивости к аминогликозидам, 6 генов β-лактамаз групп OXA, CTX-M, CARB и 5 генов устойчивости к другим антибактериальным препаратам (хлорамфеникол, макролиды, сульфаниламиды). Описаны два подобных изолята A. baumannii ST78, которые были выделены у одного пациента в июле 2012 года в больнице в Гессене, и у второго пациента в сентябре 2013 года в Баварии, причем оба пациента ранее были госпитализированы в Москве после тяжелых дорожно-транспортных происшествий

Выявленные нами штаммы P. aeruginosa являются представителями широко распространенных линий синегнойной палочки, обладающей множественной устойчивостью. Так, P. aeruginosa ST 357 с аналогичным спектром генов резистентности была обнаружена в 2023 году в Бангладеш

Можно заключить, что наиболее важными с точки зрения назначения антибактериальной терапии современными β-лактамами, карбапенемами, эпидемиологического мониторинга и выявления резистентности с помощью полимеразной цепной реакции в обследованном отделении являются для K. pneumonia гены резистентности blaTEM-150, blaNDM-1, blaCTX-M-15A, blaOXA-72; для A. baumannii гены резистентности blaCTX-M-115, blaOXA-48, blaOXA-64, blaOXA-69, blaOXA-72, blaCARB-14; для P. aeruginosa гены резистентности blaOXA-48, blaOXA-72, blaNDM-1, blaCTX-M-115.

Одной из наиболее важных проблем, возникающих из-за устойчивости к противомикробным препаратам, является ее выявление и принятие правильного решения об адекватной терапии у пациентов. b-лактамазы расширенного спектра и карбапенемазы относятся к детерминантам резистентности, распространение которых представляет наибольшую угрозу целой группе антибактериальных препаратов – цефалоспоринам различных поколений и карбапенемам. В настоящее время критерии «CLSI 2020» не рекомендуют какой-либо конкретный подтверждающий фенотипический тест для определения механизмов резистентности, это решает каждая микробиологическая лаборатория самостоятельно. В оптимальной стратегии борьбы с антибактериальной устойчивости необходимо отслеживание фенотипов резистентности клинических изолятов, сбор сведений о генах, приводящих к определенному фенотипу и оценка их значимости. К сожалению, ни один из традиционных фенотипических микробиологических методов не обеспечивают детекции всех механизмов резистентности. Эта проблема обостряется, поскольку все чаще встречаются наличие у бактерий нескольких детерминант устойчивости одновременно. В этих условиях полногеномное секвенирование помогает выявлять широкий диапазон детерминант антибактериальной устойчивости. Применение его в качестве способа генетического надзора за изменениями в спектре генов резистентности позволяет определить мишени для применения полимеразной цепной реакции, с помощью которой можно быстро и точно выявить соответствующие детерминанты и принять обоснованное решение о начальной антибактериальной терапии у каждого пациента.

В некоторых случаях молекулярно-генетические методы позволяют идентифицировать проблемные возбудители и детерминанты антибактериальной резистентности в клиническом материале даже без выделения их в чистой бактериологической культуре, что существенно ускоряет оценку клинически значимых свойств микроорганизма. Поэтому представляется перспективным проведение регулярного микробиологического мониторинга инфекции, связанной с оказанием медицинской помощи методам полногеномного секвенирования.