MODIFIED METHOD OF DISINFECTANT'S EFFICIENCY STUDY, IMITATING THE BIOFILM PRESENCE

Козуля С.В.

Кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей гигиены и экологии Государственного Учреждения «Крымский государственный медицинский университет имени С.И. Георгиевского»

МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ СРЕДСТВ, ИМИТИРУЮЩИЙ НАЛИЧИЕ БИОПЛЕНКИ

Аннотация

Метод изучения эффективности дезинфицирующих средств, предназначенных для объектов внешней среды, покрытых биопленкой. Заключается в обработке дезинфекционными средствами микроорганизмов, находящихся на плотной питательной среде, нанесенной поверх предметных стекол.

Ключевые слова: гигиена, микробиология, дезинфекция.

Kozulya S.V.

PhD in Medical sciences, Associate Professor, Department of General Hygiene and Ecology of the State Institution "Crimea State Medical University named after Giorgievsku SI»

MODIFIED METHOD OF DISINFECTANT'S EFFICIENCY STUDY, IMITATING THE BIOFILM PRESENCE

Abstract

Method of disinfectant's efficiency study, intended for the objects of external environment, covered by biofilm. Consists from treatment of microorganisms, being on a dense nourishing environment, inflicted over subject glasses, by solution of disinfectant.

Keywords: hygiene, microbiology, disinfection.

В 80-х годах XX века внимание исследователей привлек феномен, известный как «биопленка» - фиксированная на поверхностях как живых, так и неживых объектов форма существования микроорганизмов [2].

Полисахариды и другие экзополимеры, продуцируемые микрофлорой, обусловливают не только прикрепление клеток к субстрату[4], но и функционирование сообществ биопленки, создавая стабильную архи- тектонику. Сложная комплексная трехмерная структура  биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток и создает условия, способствующие симбиотическим взаимоотношениям между бактериями разных видов [5,6].

Структура биопленки и физиологические особенности составляющих ее микробных клеток обеспечивают высокую устойчивость бактериального сообщества к дезинфицирующим средствам. Такой способ существования бактерий создает определённые санитарные проблемы и делает необходимой разработку соответствующих дезинфекционных технологий, направленных на борьбу с биопленкой [3].

В идеале, дезинфекцию следует проводить после удаления  биоплёнки с обрабатываемого объекта. Однако, в ряде случаев это невозможно по техническим причинам и приводит к необходимости увеличения концентрации дезинфицирующего средства.

Следовательно, для обоснованного выбора концентрации дезинфицирующего средства и времени экспозиции, которые приведут к гарантированному обеззараживанию объектов, покрытых биоплёнкой, необходима разработка отдельной методики оценки эффективности дезинфицирующих средств.

Целью работы была разработка методики изучения эффективности дезинфицирующих средств, предназначенных для обеззараживания объектов, покрытых биопленкой.

Материалы и методы.

В качестве прототипа выбран метод исследования бактерицидной эффективности дезинфицирующих средств, предназначенных для обеззараживания поверхностей [1], который заключается в том, что для исследований используются поверхности размером 10х10 см из различных материалов, на которые наносят взвесь микроорганизмов. При необходимости имитируется белковое или фекальное загрязнение. Поверхности подсушивают и обрабатывают дезинфицирующим раствором. Для контроля эффективности обеззараживания, марлевой салфеткой, смоченной в растворе соответствующего для данного дезинфицирующего средства нейтрализатора, тщательно протирают тест-поверхность, затем салфетку погружают в пробирку  с раствором нейтрализатора. Промывную жидкость сеют на твердые питательные среды. Учет результатов проводят в течение 1-2 суток путем подсчета количества выросших колоний.

 Этот метод рассчитан на имитацию обычного загрязнения предметов, не учитывает трехмерность структуры биопленки, а также физиологические особенности составляющих ее живых и размножающихся микробных клеток, которые, в совокупности, обеспечивают высокую устойчивость бактериального сообщества к дезинфицирующим средствам.

Метод-прототип предполагает тестирование дезинфицирующего средства на тонкой пленке подсушенной взвеси тест-штаммов, которые, из-за такой обработки, находятся в состоянии пониженной физиологической активности и более чувствительны к дезинфицирующим средствам. Кроме того, по закону осмоса, в частично обезвоженную клетку дезинфицирующее средство будет проникать легче, что также исказит результаты исследования.

В связи с тем, что визуализация результатов исследования происходит после отмывания тест-поверхности с дальнейшим посевом промывной жидкости, существует риск ложно-отрицательного результата при незначительном количестве микроорганизмов, оставшихся жизнеспособными. Возможность широкого проведения исследований в любой бактериологической лаборатории также ограничивается необходимостью использования нейтрализатора и тест-поверхностей 10х10 см, не входящих в стандартный набор лабораторной посуды.

Поэтому в основу предлагаемой модификации методики была положена задача усовершенствования методики-прототипа путем замены метода нанесения тест-штаммов на тест-поверхность, что дает возможность изучать эффективность дезинфицирующих средств на жизнеспособных, а не ослабленных, микроорганизмах и существенно облегчает дальнейшую работу по визуализации результатов.

Поставленная задача решена тем, что, в предлагаемой модификации методики, дезинфекционными средствами обрабатываются микроорганизмы, находящиеся непосредственно на плотной питательной среде и используются  стандартные предметные стекла 7,5х3 см. При этом микроорганизмы, находящиеся на питательной среде и не ослабленные высушиванием, более устойчивы к дезинфицирующим средствам, что позволяет более точно оценить эффективность их применения; вместо нестандартных тест-поверхностей 10х10 см используются стандартные предметные стёкла, которые имеются в наборе лабораторной посуды любой бактериологической лаборатории; нет необходимости в применении нейтрализатора.

Методика изучения эффективности дезинфицирующих средств, предназначенных для объектов внешней среды, покрытых биопленкой, состоит из нескольких этапов:

1. Стерильной мерной пробиркой отмеряется 3 см³ сваренной или растопленной плотной питательной среды, приготовленной согласно рецептуре, рекомендованной для используемого штамма микрооргагизмов, наносится на стерильные предметные стекла 30х75 мм и выдерживается до застывания.

2.  На поверхность среды наносится 0,1 мл суточной бульонной культуры тест-штамма, разведенного по стандарту мутности 10 международных единиц, что соответствует 0,93*10⁹  клеток в мл, после чего предметное стекло оставляется на 15 минут при комнатной температуре для удаления избытка влаги с поверхности среды.

3. Установленное на подставку предметное стекло обрабатывается дезинфицирующим раствором. После экспозиции остаток дезинфицирующего средства удаляется путем орошения стерильной водопроводной водой. В целях повышения достоверности результата, оценка эффективности дезинфицирующих средств, проводится одновременно на двух стёклах.

4. Для предотвращения высыхания предметные стёкла укладываются по две штуки в чашку Петри (рисунок 1), которая термостатируется при температуре 37⁰С в течение 1-2 суток в зависимости от тест-культуры.

1. 1.  

5. Учет результатов проводится путем подсчета колоний на питательной среде.

Предлагаемая методика, в сравнении с  прототипом, существенно упрощает ход исследований, а также позволяет смоделировать условия биопленки, которая состоит не только из микрофлоры, но и из питательного субстрата.

Рис.1 - Предметные стёкла со средой в чашке Петри

Для объективной оценки эффективности этой методики были проведены параллельные исследования эффективности дезинфицирующего средства «Сурфаниос», произведенного ООО «Дезант», Украина (свидетельство о государственной регистрации дезинфицирующего средства №05.03.02-08/66 от 01.12.2011) по методике-прототипу и модифицированной методике. В обоих случаях время воздействия дезинфицирующего средства на микрофлору, то есть экспозиция, составляла 15 минут. По методике-прототипу в качестве нейтрализатора применялся раствор 0,5% лаурилсульфата натрия (сульфонол, ТУ 07510508. 135-98, производство ООО «Югсинтез», Днепропетровск). Для повышения достоверности каждое исследование проводилось в двух повторах. Также, в обязательном порядке, проводился контроль стерильности среды и ростовых качеств тест-культуры.

Результаты и их обсуждение.

Результаты оценки эффективности дезинфицирующего средства «Сурфаниос» по воздействию на три тест-штамма: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Воздействие различных концентраций дезинфицирующего средства «Сурфаниос» на тест-штаммы, количество колоний на поверхности среды. «СР»- сплошной рост, подсчету не поддаётся

тест-штамм	концентрация дезинфицирующего средства, %
	0,35	0,325	0,3	0,25	0,2	0,15	0,125
Способ – прототип, колоний на поверхности среды
Escherichia coli	-/-	-/-	-/-	-/-	12/15	25/27	34/38
Pseudomonas aeruginosa	-/-	-/-	-/-	-/-	-/-	4/5	20/27
Staphylococcus aureus	-/-	-/-	-/-	-/-	52/57	73/75	98/99
Предлагаемая методика, колоний на поверхности среды
Escherichia coli	-/-	-/-	-/-	-/-	42/53	СР	СР
Pseudomonas aeruginosa	-/-	-/-	-/-	-/-	80/73	СР	СР
Staphylococcus aureus	-/-	-/-	40/50	СР	СР	СР	СР

Как видно из представленных данных, моделирование условий биоплёнки предъявляет к дезинфицирующему средству более жесткие требования. При проведении исследований методом-прототипом «Сурфаниос» проявлял бактерицидный эффект в отношении Escherichia coli и Staphylococcus aureus до 0,25% разведения включительно. Единичные колонии отмечались в 0,2% разведении. В отношении Pseudomonas aeruginosa дезинфектант показал более высокую эффективность  - рост микрофлоры угнетался до концентрации 0,2% включительно, а единичные колонии регистрировались начиная с 0,15% разведения. При применении более низких концентраций, до 0,125% отмечался сплошной рост.

При использовании модифицированной методики оценки эффективности дезинфицирующих средств, предназначенных для объектов, покрытых биопленкой, дезинфицирующее средство закономерно демонстрировало меньшую эффективность. Рост Staphylococcus aureus угнетался до концентрации 0,325% включительно. При применении 0,3% раствора наблюдались поддающиеся подсчету колонии, переходящие в сплошной рост при концентрации 0,25%. В отношении Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa бактерицидный эффект сохранялся до концентрации 0,25% включительно. При использовании 0,2% раствора дезинфицирующего средства отмечалось поддающееся подсчету число колонии, переходящее в сплошной рост при использовании 0,15% концентрации средства «Сурфаниос».

Таким образом, предлагаемый метод наглядно продемонстрировал, что для уничтожения биопленок Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus на объектах, которые, в силу ряда причин, предварительно невозможно от них очистить (например, в некоторых узлах систем водоснабжения и кондиционирования воздуха), необходимо использовать «Сурфаниос» в концентрации 0,325% и более. Используя для данной цели метод-прототип, мы могли бы сделать ошибочный вывод о достаточности 0,25% концентрации данного дезинфицирующего средства, что привело бы к недостаточной эффективности дезинфекционных мероприятий.

Модифицированный метод  экономически выгоден, так нейтрализатор дезинфицирующего средства не требуется.  Кроме того, модифицированная методика в 38 раз снижает расход питательных сред. Метод-прототип для визуализации результатов исследования требует 2 чашки Петри диаметром 90 мм с питательной средой, налитой слоем в 4,5±0,5 мм. То есть расход среды на оценку влияния одной концентрации дезинфицирующего средства на один тест-штамм составляет 2 * 3,14 * 90² * 4,5 = 228906 мм³ = 229 см³. Предлагаемая методика требует 2 * 3 см³ = 6 см³ питательной среды.

Для описанных выше сравнительных исследований семи концентраций дезинфицирующего средства на три тестовые культуры (без учета контроля стерильности среды и ростовых качеств), было затрачено  4,94 литра питательной среды. Из них на исследования методикой-прототипом – 4,81 литров, а модифицированным методом – 0,13 литра, что наглядно демонстрирует экономическую эффективность предлагаемой методики.

Выводы:

1. Модифицированная методика изучения эффективности дезинфицирующих средств, имитирующая наличие биоплёнки на обрабатываемых объектах, позволяет определить экспозицию и концентрацию дезинфицирующих средств, предназначенных для обработки объектов,  которые, в силу ряда причин, предварительно невозможно очистить от биоплёнок.

2. Модифицированная методика экономически выгодна, так как, в сравнении с методикой-прототипом, в 38 раз снижает расход питательных сред.

3. Данная модификация методики может найти широкое применение в бактериологических лабораториях и быть использована для оценки эффективности дезинфицирующих средств, предназначенных для объектов внешней среды, покрытых биоплёнкой.

Литература

1. Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности Р 4.2.2643-10 – Офиц. Изд. – М. : Государственная система санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации, 2010г. – С. 144-147. – (Нормативний документ Государственной системы санитарно-эпидемиологического нормирования Российской Федерации. Руководство)

2. Моносахаридный состав экзополимерного комплекса бактерий-деструкторов защитных покрытий / В.В. Занина, Ж.П. Коптева, Ю.М. Юмына [и др.] // Микробиологический журнал. – 2009. - Т. 71. - №4. – С. 21-27.

3. Предупреждение формирования биопленки в гидравлической системе стоматологической установки : матеріали конф. ["Актуальні питання дезінфекційної справи"] / [Морозова Н.С., Мариевский В.Ф., Куцевляк С.В.]. – Лівів, 2008. – С. 60-61.

4. Danese P.N. Exopolysaccharide production is required for development of Escherichiacoli K-12 biofilm architecture / P.N. Danese, L.A. Pratt, R. Colter // J. Bacteriol. – 2000. – Vol. 182, N 12. – P. 3593–3596.

5. Novak J.S. Heteropolysaccharides formation by Arthrobacter viscosus grown onxylose and xylose oligosaccharsdes / J.S. Novak, S.W. Tanenbaum, J.P. Nakas // Appl. And Environ. Microbiol. – 1992. – Vol. 58, N 11. – P. 3501–3507.

6. Sutherland I.W. Biofilm exopolysaccharides: a strong and sticky ramework / I.W. Sutherland // J. Microbiol.– 2001. – №147. –P. 3– 9.