MORPHOMETRIC AND HISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE PLACENTA OF NORTHERN DOMESTIC REINDEER (RANGIFER TARANDUS)
MORPHOMETRIC AND HISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE PLACENTA OF NORTHERN DOMESTIC REINDEER (RANGIFER TARANDUS)
Abstract
Placenta fragments (5 mm thick and up to 3 cm² in area) obtained from northern reindeer (Rangifer tarandus) were fixed in 10% buffered HistoSafe formalin, then dehydrated in a solution of Isoprep with a gradual increase in concentration and poured into Histomix paraffin. Micrographs were analysed statistically using the mean and standard deviation for continuous data and the interquartile range for categorical data. Statistical significance was determined at p <0.05. Calculations were performed using IBM SPSS Statistics 26 and Microsoft Excel software. For the first time in northern domestic deer, the ability of mesenchymal stromal cells to exhibit plasticity characteristic of mesenchymal-epithelial transition has been established. In the placenta of northern domestic deer in the late stages of gestation, partial destruction of the amnion epithelium with the formation of vacuoles has been established. The cytotrophoblast cells are cubic, rounded-oval, flattened, and polygonal with sparse and moderate cytoplasm, often containing small vacuoles, which gives some cells a translucent appearance, as well as small and medium-sized nuclei. Underneath it is a plate made of PVST. Fibroblastic cells of the caruncles of the maternal part of the placenta of the northern domestic deer (rangifer tarandus) with moderate and pronounced intracellular vacuolisation, as a result of which they acquire a ring-shaped and lightened morphology, indicating vacuolar dystrophy of the epithelial cells of the chorion-allantois villi. Placental sections show vacuolar dystrophy of fibroblasts of the maternal part of the placenta, manifested in vacuolisation and changes in cell shape (ring-shaped, translucent). The capillary network is hyperemic, with moderate lymphocytic infiltration of the connective tissue of the chorion villi. In addition, polymorphic infiltration of the connective tissue of the villi and stroma of the caruncles in placentomas and pronounced hyperemia of the capillaries of the villi, as well as vacuolisation and clearing of the epithelial cells of the chorion villi, were detected.
1. Введение
Существенное снижение племенного поголовья северных домашних оленей (Rangifer tarandus), приобретают особо важное государственное значение в аграрных предприятиях и домохозяйств территории Республики Саха (Якутия) Российской Федерации , . В первую очередь это связано с вопросами репродукции и ведения селекционно-племенной работы . Одним из наиболее распространенных репродуктивных патологий у племенных оленей является бесплодие важенок и рождение нежизнеспособного молодняка — мультисистемных заболеваний, главной причиной которых является нарушения обмена веществ, гомеостаза и плацентации в период беременности, которое приводят к репродуктивным патологиям в родах и после родов . Однако этиология и патогенез плацентарной недостаточности остаются вне сферы интересов исследователей.
Современные исследования в области междисциплинарных фундаментальных достижений в области геномной селекции, иммунологии, гистологии и цитологии доказывают, что оптимальным прогностическим признаком возникших репродуктивных патологий, являются геномные и клеточные молекулярные нарушения , . Для выявления молекулярных биомаркеров ответственных за данный процесс в научных исследованиях применяются гистохимические методы биоматериала, (плацента), а полученные результаты обладают предиктивной способностью, что позволит создать диагностические тест-системы для устранения негативных явлений. В исследованиях , плаценты у импал выявлено, что её макроскопическая и гистологическая структура, а также иммуногистохимические свойства демонстрируют значительные различия между плацентами жвачных животных. Авторы , указывают на то, что плацента антилопы гну была типично синэпителиохориальной макрокотиледональной у жвачных животных с многочисленными плоскими плацентомами, развивающимися в головном роге и ни материнское желтое тело, ни аллантоис не показали иммуногистохимического окрашивания на цитохром P450 ароматазу.
Развивающаяся плацентарная недостаточность, не только негативно влияет на рост и развитие плода, но и снижает продуктивность животных, что, в итоге, приводит к значительным экономическим потерям , . Известно несколько факторов риска, которые предрасполагают к бесплодию на почве осложненной беременности, но объединяющий патогенез остается неуловимым из-за его многофакторной этиологии и плохо поддающимся корреляциями. В исследованиях , , , с помощью гистологии, иммуногистохимии и зимографии были проанализированы различные молекулы внеклеточного матрикса (металлопротеиназы, их ингибиторы и фибриллярные компоненты) в трёх сегментах матки (краниальном, среднем и каудальном) взрослых вискачей. Установлено, что изменения в матриксе эндометрия матки по краниокаудальной оси могут способствовать процессам ремоделирования матки, которые регулируют выживаемость эмбриона во время беременности , , . Кроме того, в научной литературе отсутствуют экспериментальные данные о том, какие молекулярные механизмы лежат в основе патогенеза патологического состояния важенок, связанного с нарушением плацентации н последних сроках гестации.
Морфологические параметры определения степени достаточности плаценты включают такие критерии:
– иммуномодулирующие свойства эпителиальных и мезенхимальных клеток в период имплантации и последующих сроков гестации;
– метаболизм системы «мать-плацента-плод» и митотический индекс клеток синэпителиохориальной плаценты жвачных на последних сроках периода беременности и непосредственно в родах;
– наличие выраженности фокусов апаптоза эпителиально-мезенхимных клеток синцитиотрофобластов на последних сроках гестации и в процессе родов. Заполнение пробелов в данной области знаний позволит установить основополагающие процессы, принимающие прямое или опосредованное участие в патогенезе плацентарной недостаточности и механизма развития репродуктивных патологий у самок и убытия из воспроизводства.
Цель исследования состоит из изучения морфометрической и гистохимической характеристики плаценты северных домашних оленей (rangifer tarandus).
2. Методы и принципы исследования
Для гистологического анализа были отобраны фрагменты плаценты толщиной не менее 5 мм и площадью до 3 см². Первым этапом была фиксация образцов в 10% нейтральном забуференном формалине HistoSafe (ООО «ЭргоПродакшн», Россия) на 24 часа. Затем проводилось обезвоживание с использованием раствора Изопреп (ООО «ЭргоПродакшн», Россия), где образцы последовательно проходили через серии с возрастающей концентрацией реагента, по 30 минут в каждой. Следующим шагом было уплотнение материала в двух сериях парафиновых сред Гистомикс (ООО «ЭргоПродакшн», Россия), каждая продолжительностью 50 минут. Для получения тонких срезов использовался ротационный микротом «Ротмик-2» (ЗАО «Орион Медик», Россия), с толщиной срезов 5 мкм. Готовые срезы наносились на предметные стекла и подвергались окрашиванию. Для общего обзора применялись стандартные методы (гематоксилин и эозин, ООО «ЭргоПродакшн», Россия), а для выявления специфических компонентов — специальные методики: альциановый синий для кислых гликозаминогликанов и ШИК-реакция для нейтральных гликозаминогликанов (ООО «ЭргоПродакшн», Россия), в соответствии с установленными протоколами.
При статистической обработке данных применяли описательную статистику (среднее значение ± стандартное отклонение для нормально распределенных непрерывных переменных и межквартильный размах для категориальных переменных) рассчитывали для каждой группы. Все непрерывные переменные проверяли на нормальность с использованием теста Колмогорова-Смирнова для визуальных микрофотографий. Категориальные данные оценивали с помощью теста Фишера, когда предполагаемое число клеток было <5. Результат считался статистически достоверным значимым при уровне значимости р<0,05. Все анализы проводили с использованием программного обеспечения IBM SPSS Statistics 26 («IBM Corp.», США), Microsoft Excel 2000 SPSS 10.0.5 for Windows.
3. Основные результаты
Топологические свойства полученных количественных данных показал, что у важенок северных домашних оленей на финальных этапах гестации плацентомы приобретают выпуклую форму и достигают значительных размеров (в среднем 14,6 на 8,67 см). При этом их общее количество сокращается до 4-7 единиц, рис. 1.
Рисунок 1 - Олигокотиледонная анатомическая структура плаценты важенок северного домашнего оленя после отделения
Для плаценты важенок северного домашнего оленя (Rangifer tarandus) характерно формирование отделяющими ворсины хориоаллантоиса от промежуточной пластины к поверхности определенного участка контакта спланхноплевры аллантоиса с соматоплеврой хориона. Визуализируются выраженные различия в высоте эпителиальных структур ворсин, параметрах ядер ворсин при сравнении хориоаллантоиса смежных участков фетальной части плаценты. В норме хориоаллантоис котиледона важенок северных домашних оленей на последних сроках гестации имеет типичную ворсинчатую, сильно разветвленную структуру, основу ворсин составляет рыхлая волокнистая соединительная ткань с фокусами миксоидного строения, рис. 2.
Рисунок 2 - Морфология фрагмента ворсинки хориона
Примечание: а) ув. 100, окраска гематоксилин-эозином, визуализируется плотный слой трофобласта, покрывающий поверхность ворсинки (стрелки); б) ув. 400, окраска гематоксилин-эозином, показаны клетки трофобласта, имеющие призматическую форму, с выраженной вакуолизацией цитоплазмы и наличием пигментных включений бурого цвета (стрелки)
Соединительная ткань, формирующая хориальную пластинку ворсин хориона, на единицу площади котиледона характеризовалась повышенной плотностью и обильным содержанием волокнистых элементов, рис. 3а.
Рисунок 3 - Ворсины хориона:
а) фрагмент: цитоплазма высоких призматических эпителиоцитов содержит ШИК-позитивные включения; б) строма ворсин хориона характеризуется высокой плотностью коллагеновых фибрилл (отмечены стрелками)
Примечание: а – применялась комбинированная гистохимическая окраска (альциановый синий, ШИК-реакция) с последующей ядерной окраской гематоксилином Майера, увеличение ×400; б – окраска по Ван-Гизону, увеличение ×100
На внутренней поверхности амниотической оболочки, обращенной к плоду, находились призматические эпителиальные клетки. В их верхней части была обнаружена плотная сеть мелких выростов (микроворсинок), рис. 4а.
Рисунок 4 - Фетальная часть плаценты северного домашнего оленя на последних сроках гестации (эпителий амниона с частичным разрушением и перинуклеарной вакуолизацией, стрелки)
Примечание: окраска гематоксилин и эозин; увеличение: а – х100; б – х400
Подавляющее большинство ворсинок хориона покрыто характерным двухслойным эпителием, (трофобластом). Этот трофобласт состоит из двух слоев: внутреннего цитотрофобласта и наружного синцитиотрофобласта. Далее следует хориальная пластинка, образованная рыхлой волокнистой соединительной тканью (РВСТ). Клетки цитотрофобласта отличаются разнообразием: они могут быть кубическими, округло-овальными, иметь три ядра (трехъядерные), быть уплощенными или крупными с двумя ядрами (двуядерные гигантские). Также встречаются клетки фибробластического ряда, в которых из-за скопления пузырьков (вакуолей) внутри они приобретают вид колец (перстневидная морфология) или становятся более прозрачными (просветленная морфология). Эти изменения указывают на дистрофические процессы, связанные с образованием вакуолей, в клетках эпителия ворсин хориона, что проиллюстрировано на рис. 4.
Отмечается рассеянная полиморфноклеточная инфильтрация в рыхлой волокнистой соединительной ткани ворсин хориона и стромальных элементах. Наблюдается резко выраженная гиперемия капиллярного русла ворсин. Эпителий ворсин хориона кубический, с умеренной внутриклеточной вакуолизацией, поэтому клетки приобретают перстневидную и просветленную морфологию, рис. 5а.
Рисунок 5 - Плацентома, поперечный срез карункула с котиледоном северного домашнего оленя на последних сроках гестации:
1 – крипты; 2 – ворсины хориона; 5 – отслаивание эпителия; 6 – вакуолизация клеток РВСТ ворсин хориона
Примечание: окраска гематоксилин и эозин; увеличение: а – х40, б – х400,
Цитоплазма в этих клетках содержится в небольшом или умеренном количестве и часто содержит мелкие вакуоли, из-за чего некоторые клетки выглядят светлыми. Ядра клеток небольшие или средние по размеру. Под слоем цитотрофобласта находится пластинка из рыхлой волокнистой соединительной ткани (РВСТ), что подтверждается данными других исследований , . Фибробласты в материнской части плаценты северного оленя характеризуются умеренной или выраженной вакуолизацией (образованием вакуолей внутри клеток). Это приводит к тому, что клетки приобретают вид «перстневидных» или просветленных, что указывает на вакуольную дистрофию клеток эпителия ворсин хориоаллантоиса. Под эпителием располагается густая, разветвленная сеть капилляров с выраженным полнокровием (гиперемией). В соединительной ткани и строме ворсин хориоаллантоиса котиледона наблюдается инфильтрация лимфоцитами, варьирующая от слабой до умеренной. В плацентомах отмечается рассеянная инфильтрация различными типами клеток в рыхлой волокнистой соединительной ткани ворсин хориоаллантоиса котиледонов и стромальных элементах крипт карункулов. Капиллярное русло ворсин котиледонов сильно переполнено кровью (резко выраженная гиперемия). Эпителий ворсин хориоаллантоиса состоит из кубических клеток с умеренной вакуолизацией, что придает им «перстневидный» или просветленный вид. В работе , , посвященной водяному оленю, отмечается сходство его морфологических характеристик с северным оленем (R. tarandus tarandus). Плацентомы у этого вида имеют овальную форму и характеризуются разветвленной структурой ворсин, разделенных на три слоя: глубокий, средний и поверхностный. Биноклеарные клетки трофобласта (BNC) преимущественно располагаются в глубоком слое, что подтверждает синепителиохориальный тип плаценты.
Исследования , нормальной плаценты крупного рогатого скота в период родов, включающие гистологические, гистохимические и электронно-микроскопические методы, показали следующее параметры плацентомы (карункулы и котиледоны) до родов характеризуются тесным контактом трофобласта с криптовым эпителием, образующим четкую границу. На ультраструктурном уровне наблюдается переплетение материнских и плодных микроворсинок, иногда с признаками повреждений и атрофии эпителия. Отделение плаценты происходит без значительного повреждения клеток обоих типов. Трофобласты активно поглощают эритроциты, накапливая железосодержащий пигмент. Плацента жвачных животных характеризуется неоднородностью плацентомов по размеру и количеству, но при этом всегда содержит двуядерные клетки трофобласта (15-20%). Эти клетки, вырабатывающие гормоны, мигрируют и сливаются с клетками матки, формируя тринуклеатные гибридные клетки и синцитиальные бляшки. У разных видов оленей этот процесс изучен недостаточно.
Известно , что крупнозернистые лимфоциты обнаруживаются только в плацентомальном эпителии и связаны с гибридными структурами, однако их функция остается неясной. Известно, что гипоксия оказывает негативное влияние на репродуктивные процессы у млекопитающих, приводя к гестационным осложнениям . Исследования адаптации к гипоксии у мышей-оленей показали, что низкогорные особи при недостатке кислорода страдают от задержки роста плода, в то время как высокогорные особи сохраняют нормальный рост благодаря увеличению объема плаценты, что улучшает обмен веществ. Изменения в экспрессии генов плаценты, многие из которых аналогичны генам человека, участвующим в развитии плаценты , позволяют лучше понять общие механизмы адаптации к гипоксии и факторы, влияющие на рост плода. В рамках исследования, матки 25 беременных импал (срок беременности варьировался от 49 до 113 дней из общего срока в 190 дней) были подвергнуты детальному гистологическому и иммуногистохимическому анализу , . Было установлено, что аллантохорион плотно прилегает к амниону, но не срастается с ним. Тип плацентации у импалы соответствует таковому у других жвачных животных. Ворсины эмбриональной ткани глубоко внедряются в крипты материнской плаценты. Несмотря на общий тип плацентации, структура и биохимические характеристики плаценты импалы демонстрируют значительные отличия даже в сравнении с другими жвачными животными.
4. Заключение
1. На поздних сроках беременности у северного домашнего оленя (Rangifer tarandus) плацента представлена синэпителиохориально-аллатоисной структурой, и непосредственно в родах происходит отчетливое ремоделирование и потеря адгезии на границе раздела плод-мать.
2. Установили снижение количества плацентом и большую площадь поверхности карункулов и котиледонов в сравнении с другими жвачными животными.
3. В стенках перегородок (септ) между долями плаценты обнаружено свободное расположение ворсинок хорионаллантоиса. Межклеточное вещество этих перегородок содержало много нейтральных мукополисахаридов, в то время как в ворсинках хорионаллантоиса преобладали кислые мукополисахариды.
4. Крипты сливались, образуя структуры, напоминающие железы. В эпителии карункул (выступов на плаценте) наблюдалось уменьшение количества клеток трофобласта с тремя ядрами, а в ворсинках хорионаллантоиса в части плаценты, обращенной к плоду, выявлены признаки вакуольной дистрофии (повреждения).
5. Процесс отделения плодных оболочек во время родов связан с уменьшением активности фибробластов.
6. Трофобласт северных домашних оленей (Rangifer tarandus) состоит из двух популяций клеток: неядерных клеток трофобласта и двуядерных гигантских клеток трехядерных гибридных клеток.
4.1. Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки проблемы:
1. Контроль пространственной деградации внеклеточного матрикса и последующее инициирование родового процесса могут осуществляться за счёт взаимодействия плодного и материнского компартментов. При этом механизмы, ответственные за утрату адгезивных свойств плодных оболочек после изгнания плода, в плаценте северного оленя (Rangifer tarandus) остаются слабо изученными и не имеют чёткого теоретического обоснования.
2. Установленные в ходе исследований материалы дают основание для разработки ветеринарных технологий краткосрочных прогнозов риска осложнений родов и в дальнейшем репродуктивных патологий, что связано с преждевременным выбытием из маточного стада племенных важенок северного домашнего оленя (Rangifer tarandus).