Delayed amyloidogenesis after transient cerebral ischemia in rats with spontaneous hypertension: search for molecular biomarkers

Церебральная ишемия (ишемический инсульт) сохраняет статус одной из ведущих причин смертности и инвалидизации в глобальном масштабе. Патофизиологическим ядром является острое нарушение перфузии, запускающее каскад событий: дисфункцию гемато-энцефалического барьера, расстройство клиренса метаболитов и быструю гибель нейронов, что обосновывает парадигму «время — мозг»

Однако существующие исследования носят преимущественно фрагментарный характер. Традиционно маркеры этих путей, такие как амилоидный предшественник (APP), фактор фон Виллебранда (vWf, маркер эндотелиального повреждения) и X-связанный ингибитор апоптоза (XIAP, регулятор клеточной смерти и воспаления)

Цель исследования — провести сравнительную оценку динамики сывороточных биомаркеров, представляющих ключевые патогенетические пути (амилоидный — APP, гемостатический — фактор фон Виллебранда/vWf, и апоптотический — X-связанный ингибитор апоптоза/XIAP), в ответ на острую транзиторную фокальную церебральную ишемию у спонтанно гипертензивных крыс (SHR). Исследование проведено на адекватной модели фоновой цереброваскулярной патологии — спонтанно гипертензивных крысах (SHR). Эта модель воспроизводит ключевой элемент человеческой патологии — гипертензивную микроангиопатию, что критически важно для изучения специфики ишемического повреждения на измененном сосудистом фоне.

Ишемия моделировалась методом 60-минутной транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (rMCAo) с последующей реперфузией. Контрольную группу составили животные, подвергнутые ложной операции (sham-operated).

Проведено открытое рандомизированное контролируемое экспериментальное исследование на животных с параллельными группами. Работа выполнена на базе Научно-исследовательского института физиологии (Санкт-Петербург, Россия) с использованием первичных данных, полученных специально для целей данного исследования, и одобрена локальным этическим комитетом (Протокол № 0210 от 17.03.2025). Исследование проводилось на 30 самцах спонтанно гипертензивных крыс (SHR) в возрасте 12 месяцев (±2 недели) и массой 350±50 г, что соответствует модели хронической гипертензивной микроангиопатии. После 7-дневной адаптации все животные, соответствовавшие критериям удовлетворительного общего состояния, методом стратифицированной рандомизации (по массе тела) были распределены в две группы в соотношении 1:1: основную группу, подвергнутую 60-минутной транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (rMCAo) с реперфузией (n=15), и контрольную группу ложной операции (sham-operated, n=15). Критериями исключения после вмешательства служили техническая неудача операции, ранняя послеоперационная летальность по неуточненной причине или развитие тяжелых осложнений. Содержание животных осуществлялось в стандартных условиях вивария. Неврологический статус оценивался по шкале Гарсии до операции, а также на 1-е, 3-и и 7-е сутки после нее. Концентрация сывороточных биомаркеров (APP, vWf, XIAP) определялась методом иммуноферментного анализа (ИФА) на 7-е сутки. Данный дизайн направлен на установление причинно-следственной связи и минимизацию систематических ошибок.

Всем животным под общей комбинированной анестезией (золетил, 10 мг/кг + рометар, 5 мг/кг, внутримышечно, с поддержанием болюсами золетила по мере необходимости) выполнили хирургическое вмешательство на сонных артериях с постоянным мониторингом и поддержанием ректальной температуры на уровне 37,0 ± 0,5 °C. В группе rMCAo (n=15) после доступа к сосудам шеи проводили 60-минутную транзиторную окклюзию средней мозговой артерии путем интралюминального введения силиконизированного нейлонового филамента (≈0.37 мм) с последующей его экстракцией для запуска реперфузии. Животным контрольной группы (sham-operated, n=15) выполняли идентичную процедуру, включая введение филамента, но без его продвижения и создания окклюзии, что моделировало сопоставимый хирургический стресс в отсутствие ишемии. После операции всем животным проводили подкожную регидратацию (1,0 мл физиологического раствора) и анальгезию (карпрофен, 5 мг/кг), рану ушивали с последующей антисептической обработкой. До полного восстановления от анестезии животных содержали в индивидуальных термостатируемых камерах, после чего возвращали в виварий для ежедневного клинического наблюдения.

Первичными конечными точками данного исследования являлись количественные изменения сывороточных концентраций биомаркеров ключевых патогенетических путей — амилоидного (амилоидный предшественник, APP), гемостатического (фактор фон Виллебранда, vWf) и антиапоптотического (X-связанный ингибитор апоптоза, XIAP), измеренные на 7-е сутки после вмешательства. Вторичной конечной точкой служила динамика неврологического дефицита, оцениваемая по шкале Гарсии для валидации модели и поиска клинико-молекулярных корреляций.

Концентрации биомаркеров определяли методом твердофазного сэндвич-иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием коммерческих наборов для крысиных белков (Helicon) на автоматическом спектрофотометре Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific). Все образцы анализировали в двух повторностях вслепую, в рандомизированном порядке. Калибровочные кривые строили с использованием 4-параметрической логистической регрессии, по которым автоматически рассчитывали концентрации в образцах.

Неврологическую оценку по шкале Гарсии (от 0 до 18 баллов) проводили до операции, а также на 1, 3 и 7 сутки после нее. Оценка включала 6 стандартных тестов. Процедура выполнялась одним обученным исследователем, не знавшим групповой принадлежности животного, в стандартных условиях.

Статистический анализ выполняли в SPSS Statistics v.23.0. Проверку нормальности распределения данных осуществляли тестом Шапиро-Уилка (p < 0,10). Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (M ± SD) или медиана с интерквартильным размахом (Me [Q1; Q3]). Для сравнения групп использовали t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили с применением коэффициента Спирмена.

В соответствии с поставленными задачами было проведено сравнение динамики неврологического статуса и уровня сывороточных биомаркеров между группами rMCAo и Sham. Модель транзиторной ишемии вызвала ожидаемый временный неврологический дефицит. В группе rMCAo на 1-е сутки наблюдался тяжелый дефицит (5,0 [4,0; 6,0] баллов по шкале Гарсии), который к 3-м суткам частично регрессировал (10,0 [9,0; 11,0] баллов), а к 7-м суткам полностью нивелировался (18,0 [18,0; 18,0] баллов). Различия с группой Sham, сохранявшей стабильно нормальный статус (18 баллов), были высокодостоверны на 1-е и 3-и сутки (p < 0,001), но отсутствовали на 7-е сутки (p > 0,999), что свидетельствует о полном функциональном восстановлении (Табл. 1).

На фоне этого восстановления на 7-е сутки в группе rMCAo были выявлены стойкие изменения в сывороточном профиле исследуемых биомаркеров. Статистически значимое повышение было подтверждено для амилоидного предшественника (APP). Уровень фактора фон Виллебранда (vWf) показал тенденцию к увеличению, не достигшую общепринятого уровня значимости (p=0,132). Концентрация X-связанного ингибитора апоптоза (XIAP) значимо не изменилась. Результаты демонстрируют, что, несмотря на полное клиническое восстановление, транзиторная ишемия на фоне гипертензии индуцирует долгосрочные молекулярные сдвиги, наиболее выраженные в амилоидном пути (Табл. 2).

Корреляционный анализ (метод Спирмена) в группе rMCAo выявил умеренную отрицательную статистически значимую связь между выраженностью неврологического дефицита на 1-е сутки и уровнем APP в сыворотке на 7-е сутки (ρ = -0,65, p = 0,03). Это означает, что более тяжелый исходный неврологический дефицит ассоциирован с более высоким уровнем APP в отдаленном периоде. Достоверных корреляций между баллом по шкале Гарсии и уровнями vWf или XIAP обнаружено не было (p > 0,05 для всех сравнений).

В послеоперационном периоде у всех животных наблюдались ожидаемые явления, связанные с хирургическим вмешательством и анестезией: временное снижение двигательной активности и потребления пищи/воды, купируемое подкожной регидратацией и плановой анальгезией (карпрофен), а также преходящий отек тканей в области операционного доступа. В группе rMCAo (n=15) зарегистрировано 4 случая (26,7%) летального исхода в первые 24 часа после операции. Гибель животных, классифицированная как неожиданное серьезное нежелательное явление, вероятно связанное с обширным ишемическим повреждением, наступала на фоне прогрессирующей неврологической симптоматики и респираторного дистресса. Данные животные были исключены из окончательного анализа в соответствии с протоколом. У всех выживших животных (n=11 в группе rMCAo и n=15 в группе Sham) в течение 7-суточного наблюдения не отмечено признаков инфекции операционной раны, непредвиденных неврологических или поведенческих осложнений. Таким образом, основным нежелательным явлением исследования была прогнозируемая периоперационная летальность, частота которой соответствует известным рискам используемой экспериментальной модели.

Проведенное исследование выявило, что острая транзиторная церебральная ишемия на фоне артериальной гипертензии индуцирует скоординированный системный молекулярный ответ. Ключевым доказательством данного утверждения служит формирование специфического сывороточного профиля к 7-м суткам, характеризующегося значимым повышением уровня амилоидного предшественника (APP) и дисбалансом гемостатических маркеров, включая фактор фон Виллебранда (vWf). Этот профиль отражает сопряженную активацию амилоидогенеза и эндотелиальную дисфункцию.

Особый интерес представляет отрицательный результат — отсутствие динамики уровня сывороточного X-связанного ингибитора апоптоза (XIAP). Данный факт противоречит сообщениям о повышении его тканевой экспрессии при ишемии и может объясняться внутриклеточной локализацией основной функции XIAP, неоптимальным временным окном оценки (7-е сутки) или модулирующим влиянием хронической гипертензии на апоптотические пути. Таким образом, диагностическая ценность сывороточного XIAP в качестве самостоятельного маркера ишемического повреждения в отдаленном периоде представляется ограниченной, что актуализирует проблему валидации тканевых биомаркеров в периферических жидкостях.

Принципиально важным аспектом является выявление диссоциации между клиническим и молекулярным уровнями восстановления. Несмотря на нормализацию неврологического статуса по оценочным шкалам, в сыворотке крови сохранялся патологически измененный профиль. Это указывает на то, что скорость функционального восстановления опережает биохимическую нормализацию. Сохранение измененных уровней APP и vWf свидетельствует о латентно продолжающемся патологическом процессе, который может негативно влиять на нейропластичность, сосудистый тонус и репаративные системы, повышая уязвимость мозга к повторным повреждениям. Стойкий дисбаланс факторов амилоидогенеза, в частности, может служить патогенетической основой для развития отсроченного когнитивного дефицита, что согласуется с клиническими данными, связывающими биомаркеры инсульта с долгосрочными когнитивными исходами

В целом, полученные данные согласуются с современными представлениями о том, что ишемия непосредственно модулирует процессинг APP, усиливая генерацию амилоидогенных пептидов, а сосудистое повреждение способствует развитию не только амилоидной, но и тау-патологии. Появление амилоидных компонентов в системном кровотоке может быть объяснено их активным транспортом из церебрального компартмента на фоне ишемии

Интерпретация результатов учитывает ограничения исследования, к которым относятся специфика модели (самцы SHR), дизайн с единственной временной точкой оценки, отсутствие формализованного расчета размера выборки и использование суррогатных конечных точек. В свете указанных ограничений, полученные данные носят преимущественно гипотезогенерирующий характер, однако подчеркивают возможность раздельного воздействия на быстрое функциональное восстановление и отдаленные нейродегенеративные последствия.

Настоящая работа устанавливает, что после транзиторной ишемии на фоне гипертензии сохраняется патологический сывороточный профиль, сочетающий маркеры амилоидогенеза и эндотелиальной дисфункции. Это свидетельствует о формирующемся «окне уязвимости» для отдаленных последствий церебральной ишемии.

Вывод 1. На релевантной модели гипертензивной микроангиопатии (SHR) экспериментально продемонстрирована диагностическая ценность комплексной оценки сывороточных биомаркеров APP и vWf для выявления стойких молекулярных нарушений после транзиторной церебральной ишемии. Ключевым является выявление диссоциации между клиническим и биохимическим восстановлением: нормализация неврологического статуса происходила на фоне персистирующего патологического сывороточного профиля, что указывает на наличие скрытых, субклинических нарушений, недоступных для стандартного клинического обследования.

Вывод 2. Полученные данные ставят под сомнение целесообразность использования сывороточного X-связанного ингибитора апоптоза (XIAP) в качестве самостоятельного системного маркера отдаленных последствий ишемии в исследованном временном окне (7-е сутки) на фоне артериальной гипертензии. Этот отрицательный результат, вероятно обусловленный тканеспецифичностью его экспрессии, является важным самостоятельным научным результатом, который указывает на необходимость тщательной временной и контекстуальной валидации биомаркеров, обнаруженных в тканях, при их исследовании в периферических биожидкостях. Эти два вывода суммируют основной позитивный результат (обоснование мультимаркерного подхода) и важный негативный результат (пересмотр роли XIAP), придавая заключению большую структурную ясность и практическую ориентированность.