MORPHOFUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF MICE HEPATOCYTES NUCLEI IN COMBINED APPLICATION OF LEAD ACETATE AND ALPHA-TOCOPHEROLE

Купша Е.И.¹, Алиев Л.Л.², Харченко С.В.³, Шаповалова Е.Ю.⁴

¹ORCID: 0000-0002-4572-6732, кандидат медицинских наук, доцент, ²ORCID: 0000-0001-9401-4398, кандидат медицинских наук, доцент, ³ORCID: 0000-0002-9434-3789, кандидат медицинских наук, доцент, ⁴ORCID: 0000-0003-2544-7696, доктор медицинских наук, профессор,

ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», г. Симферополь.

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДЕР ГЕПАТОЦИТОВ МЫШЕЙ ПРИ СОЧЕТАННОМ ПРИМЕНЕНИИ АЦЕТАТА СВИНЦА И АЛЬФА-ТОКОФЕРОЛА

Аннотация

Приведены количественные и качественные характеристики ядер гепатоцитов мышей при 30- суточном ежедневном пероральном введении альфа-токоферола и малых доз ацетата свинца. С использованием гисторадиоавтографии, электронной микроскопии и морфометрии определены параметры изменений в ядрах гепатоцитов. Установлено, в сравнении с контролем, достоверное снижение площади эухроматина с одновременным повышением его функциональной активности в 2,5 раза для светлых и, в 3,5 раза — для темных гепатоцитов. Все морфометрические показатели ядер снижены. Вектор защитных реакций фиксируется на гиперторофии и гиперплазии ядрышек. Результаты исследований показали, что применение альфа-токоферола при свинцовой интоксикации не в полной мере компенсирует дисфункцию ядерного аппарата.

Ключевые слова: свинец, тяжелые металлы, токоферол, витамин Е, антиоксиданты, печень, гепатоциты, ядро.

Kupsha E.I.¹, Aliev L.L.², Kharchenko S.V.³, Shapovalova E.Yu.⁴

¹ORCID: 0000-0002-4572-6732, MD, Associate professor, ²ORCID: 0000-0001-9401-4398, MD, Associate professor, ³ORCID: 0000-0002-9434-3789, MD, Associate professor, ⁴ORCID: 0000-0003-2544-7696, MD, Professor,

FSAEI of HE Vernadsky Crimean Federal University, Simferopol

MORPHOFUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF MICE HEPATOCYTES NUCLEI IN COMBINED APPLICATION OF LEAD ACETATE AND ALPHA-TOCOPHEROLE

Abstract

Quantitative and qualitative characteristics of hepatocytes nuclei of mice are presented at 30-day daily oral supplementation of alpha-tocopherol and small doses of lead acetate. With the use of histoautoradiography, electron microscopy and morphometry, the parameters of changes in the nuclei of hepatocytes are determined. It is established, in comparison with the control, a significant decrease in the euchromatin area with a simultaneous increase in its functional activity by 2.5 times for light and, by 3.5 times for dark hepatocytes. All the morphometric parameters of nuclei are reduced. The vector of protective reactions is fixed on hypertrophy and hyperplasia of the nucleoli. The results of the studies showed that the use of alpha-tocopherol in lead intoxication does not fully compensate the dysfunction of the nuclear apparatus.

Keywords: lead, heavy metals, tocopherol, vitamin E, antioxidants, liver, hepatocytes, nucleus.

Обзор экспериментальных исследований последних лет свидетельствует, что α-токоферол используется организмом селективно и обладает иммуномодулирующим действием, подавляет местное и хроническое воспаление, уменьшает свертываемость крови и тромбообразование, оказывает антиатеросклеротическое и антиканцерогенное действие, включающее модуляцию передачи клеточных сигналов, регулирование транскрипции и индукцию апоптоза [1], [4], [5], [6]. Сообщается, что при определенных концентрациях α-токоферол вызывает увеличение микровязкости глубоколежащих областей липидного бислоя и жесткости поверхностных, в частности, микросом гепатоцитов [2]. Между тем, физико-химическое состояние липидного бислоя является важнейшим параметром регуляторной системы пероксидного окисления липидов (ПОЛ), нарушения в которой оказывают значительное влияние на активность мембрано-связанных ферментов и приводят к изменению функционального состояния клетки при хронической свинцовой интоксикации [3], [7]. Установлено, что свинец-индуцированный оксидативный стресс индуктирует клеточную неустойчивость окислительно-восстановительных реакций, что приводит к повреждению свободными радикалами митохондриальной и ядерной ДНК, мутациям, повреждениям липидов и протеинов, трансдукции и транскрипции генов, вовлеченных в регуляторные пути митоза [8], [9], [10]. Таким образом, сокращая возможности свинца взаимодействовать с критичесими биомолекулами в индукции оксидативного стресса, усиливая антиоксидатную систему с помощью экзогенного поступления антиоксидантов, в том числе витамина Е, можно ожидать положительный эффект, что обосновывает актуальность цели – установление морфофункциональных параметров ядер гепатоцитов при сочетанном поступлении в организм ацетата свинца и альфа-токоферола.

Свинцовую интоксикацию моделировали на 6 самцах белых мышей линии Balb/c, которые получали перорально ацетат свинца в дозе 1 мг/100 г массы тела и масляный раствор альфа-токоферола в дозе 0,2 мг/100 г., в течение 30 суток. 5 животных служили контролем. Образцы ткани печени исследовались с применением световой и электронной микроскопии, гисторадиоавтографии, морфометрии. Для получения сопоставимых результатов с применением метода гисторадиоавтографии эксперимент завершали в одно и то же время суток – 12 часов дня. За 1 час до взятия материала животным внутримышечно вводили меченный предшественник ДНК-3Н-тимидин в дозе 6,5 мкКu/г. Метод применен с целью установления активности синтеза ДНК клетками паренхимы печени [Епифанова]. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм покрывали фотоэмульсией – М (разведение 1:3), экспозиция составляла 14 дней. После фиксации и проявки срезы окрашивали 1% спиртовым раствором толуидинового синего. Гисторадиоавтографическую метку (зерна серебра) подсчитывали под световым микроскопом (глицериновая иммерсия, увеличение 90х10х1,25). Морфометрия проведена с применением оптического анализатора изображения «OLIMPUS BH-2» с использованием лицензионного программного обеспечения «Видеотест – Морфология» и стандартного пакета статистических программ Excel с учетом числа срезов и количества животных (Г.Г.Автандилов, 1990). Использовали t-критерий Стьюдента. Статистически достоверными считали изменения при Р≤0,05.

Морфометрический метод показал, что средняя площадь профильного поля ядер снижена до 21,26±0,65 мкм², что составляет 34% от контроля (см. табл. 1). Процент бинуклеарных светлых клеток паренхимы достигает 6,47±0,35%, что составляет 87,52% от контрольных значений.

 

Таблица 1 – Морфометрические показатели ядер гепатоцитов при сочетанном перооральном применении ацетата свинца и альфа-токоферола (Pb+Е) в сравнении с контролем (К)

Параметры		К	Pb+E
Площадь профильного поля ядер, мкм2	М m %	62,07 7,22	21,26*** 0,65 34,25
Максимальный диаметр ядер, мкм	М m %	10,3 0,74	5,23*** 0,09 50,77
Минимальный диаметр ядер, мкм	М m %	6,27 0,15	4,30*** 0,06 68,58
Средний диаметр ядер, мкм	М m %	8,27 0,39	4,78*** 0,07 57,79
Периметр ядер, мкм	М m %	30,2 2,73	15,43*** 0,25 51,09

Примечание: звездочками указаны достоверно значимые отклонения, где вероятность ошибки в сравнении с контролем: * - р < 0,05;  ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.

Среди общей популяции гепатоцитов часто встречаются двуядерные клетки и клетки с ядрами небольших размеров. Процент двуядерности для светлых гепатоцитов составляет 6,73±0,35%, для темных гепатоцитов – 8,0±1,41% (см. табл. 2).

 

Таблица 2 – Морфофункциональные показатели гепатоцитов при сочетанном перооральном применении ацетата свинца и альфа-токоферола (Pb+Е) в сравнении с контролем (К)

ИМК (‰)		К	Pb+E
Светлые гепатоциты	М m %	43,31 9,1	114,34** 11,94 264
Темные гепатоциты	М m %	30,18 5,28	106,12* 27,77 351,62
% двуядерных светлых гепатоцитов	М m %	7,69 0,91	6,73 0,35 87,52
% двуядерных темных гепатоцитов	М m %	12,89 3,44	8,00 1,41 62,06
% гетерохроматина в ядре	М m %	40,10 0,87	87,35*** 2,93 220,90
% площади ядрышка	М m %	7,44 0,16	11,57*** 1,52 155,51
% гранулярного компонента	М m %	82,01 0,95	86,43* 3,09 105,39

 

В 3-й зоне ацинуса отмечается наличие двуядерных гепатоцитов и гепатоцитов небольших размеров с мелкими круглыми ядрами. Среди этих клеток отмечаются картины митоза и включение ³Н-тимидина. Для 3-ей зоны ацинуса характерно преобладание светлых гепатоцитов. Они имеют полигональную форму и ядра с преобладанием эухроматина. В кариоплазме обычно выявляются два, часто двойных, довольно крупных округлой формы ядрышка. Одно из ядрышек зачастую прилежит к кариолемме. Такие ядра чаще имеют овальную форму и большие размеры.

При электронномикроскопическом исследовании компонентов долек выявляется хорошая сохранность ультраструктур. Ядра гепатоцитов имеют овальную форму, четко контурированы, их кариолемма утолщена. Наружная мембрана содержит полирибосомы и часто контактирует с прилежащими цистернами ГрЭПС. Гетерохроматин хорошо выражен и образует значительные скопления по всей кариоплазме. Количество гетерохроматина является высоким и составляет 87,35±2,93% от общей площади ядра. В ядре обычно находятся два, часто гипертрофированных ядрышка, с выраженным преобладанием гранулярного компонента, составляющего 79,74±1,60%. Выявляются признаки внутриклеточной регенерации. Отмечается компенсаторная гиперплазия ядрышек и умеренное увеличение их размеров (рис.1).

В некоторых ядрышках наблюдается перегруппировка гранулярного и фибриллярного компонентов на две отчетливые зоны, что характерно для избирательного действия патологического фактора.

Рис. 1 – Фрагмент гепатоцита. Гиперплазия и гипертрофия ядрышек с эффектом удвоения. Электронная микрофотография. Ув. х 8000

Одно из ядрышек более крупное и зачастую прилежит к кариолемме. Площадь профильного сечения ядрышек достигает 155% к контролю и составляет 11,57±1,52% от площади ядра (см. табл. 2). В кариоплазме одноядерных гепатоцитов отмечается одно ядрышко кольцевидной формы, а в двуядерных гепатоцитах по 3-4 мелких округлых ядрышка, что свидетельствует об их гиперплазии. В двуядерных гепатоцитах зафиксировано преобладание эухроматина над гетерохроматином. Гиперплазия ядрышковой составляющей ядерного генома и визуализируемое эуфункциональное состояние дезоксирибонуклеопротеидов свидетельствуют о повышенной биосинтетической активности бинуклеарной популяции клеток паренхимы печени.

Несмотря на то, что процент функционально неактивного гетерохроматина является высоким, процессы биосинтеза ДНК идут очень активно, о чем свидетельствует превышение индекса меченных светлых и темных гепатоцитов над контрольными значениями практически в 3 раза. Электронномикроскопический маркер активности транскрипционных внутриядерных процессов – размеры и количество ядрышек – также выявляет тенденцию к интенсификации биосинтеза рибонуклеопротеидов. Как закономерность, выявлялись признаки гипертрофии и гиперплазии ядрышек. Компенсация количества ядерного генома, призванного обеспечить структурную основу процессов цитоплазматической трансляции белков также является удовлетворительной по показателю двуядерности гепатоцитов. Однако, выявленный нами комплекс морфометрических изменений (снижения) показателей размеров ядер, уменьшения доли транскрибируемого эухроматина при практически равной контрольным показателям доли рибосомсинтезирующих локусов ядрышек (гранулярного компонента) позволяют говорить о дисфункции в системе ядерного пластического обмена и морфогенеза гепатоцитов, предотвратить которую, в полной мере, экзогенный антиоксидант не может.

Список литературы / References

1. Jan A.T. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants/ A.T. Jan, Azam M. and all. //Int. J.Mol.Sci. – 2015.–Vol.16(12).–Р.29592–29630. doi:10.3390/ijms161226183
2. Leibfritz D., Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease /D. Leibfritz, J. Moncol, M.Т. Cronin // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2007. – Vol.39(1). – Р. 44–84.
3. Tasleem A.J. Heavy Metals and Human Health: Mechanistic Insight into Toxicity and Counter Defense System of Antioxidants / A.J. Tasleem, A. Mudsser and all// Int. J.Mol.Sci. – 2015. – Vol.16.(12). – Р.29592–29630. doi:10.3390/ijms161226183
4. Meng H. The Protective Effect of Gangliosides on Lead (Pb)-Induced Neurotoxicity Is Mediated by Autophagic Pathways/ H. Meng, L.Wang and all // Int.J.Environ.Res.PublicHealth.– 2016.– Vol.13(365). doi:10.3390/ijerph13040365
5. Das K.K. α-tocopherol supplementation prevents lead acetate and hypoxia-induced hepatic dysfunction / K.K. Das, J.G. Jargar, S. Saha and all//Indian J Pharmacol. – 2015. – Vol.47(3). – Р. 285–291. doi: 10.4103/0253-7613.157126
6. Kasperczyk S. α-Tocopherol supplementation and the oxidative stress, homocysteine, and antioxidants in lead exposure/ S. Kasperczyk, M. Dobrakowski and all //Archives of Environmental & Occupational Health. – 2016. – Vol. 72(3) doi:10.1080/19338244.2016.1182112
7. Khalaf A.A. The protective effect of green tea extract on lead induced oxidative and DNA damage on rat brain/A.A. Khalaf, Walaa A.M. and all// NeuroToxicology.–2012.–Vol.33(3).–P.280-289. doi:10.1016/j.neuro.2012.02.003
8. Chervona Y. The control of histone methylation and gene expression by oxidative stress, hypoxia and metals / Y. Chervona, M. Costa // Free radical biology & medicine. – 2012. – Vol.53(5). – Р.1041-1047. doi:10.1016/j.freeradbiomed.2012.07.020
9. Dua T.K. Cytoprotective and Antioxidant Effects of an Edible Herb, Enhydrafluctuans Lour. (Asteraceae), against Experimentally Induced Lead Acetate Intoxication /T.K. Dua, S. Dewanjee, R. Khanra et al.// PLoS ONE. – 2016. – Vol.11(2). – Р.0148757. doi:10.1371/journal.pone.0148757
10. Alya A. Oxidative stress, biochemical alterations, and hyperlipidemia in female rats induced by lead chronic toxicity during puberty and post puberty periods / A. Alya, D.B. Ines and all// Iranian Journal of Basic Medical Sciences. – 2015. – Vol. 18(10). – Р.1034-1043.