ОСОБЕНОСТИ ЭКСПРЕССИИ CD68 МАКРОФАГОВ В КОЖЕ И СЛИЗИСТОЙ 12-ПЕРСТНОЙ КИШКИ У БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ АССОЦИИРОВАННОМ С ГЛЮТЕНОВОЙ ЭНТЕРОПАТИЕЙ

Яссер Халед Абдель Карим Масадех¹, Притуло О.А.², Филоненко Т.Г.³

¹Канд.н., ²Д.мед.н., профессор, ³доцент, Государственное учреждение «Крымский государственный медицинский университет имени С.И. Георгиевского»

ОСОБЕНОСТИ ЭКСПРЕССИИ CD68 МАКРОФАГОВ В КОЖЕ И СЛИЗИСТОЙ 12-ПЕРСТНОЙ КИШКИ У БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ АССОЦИИРОВАННОМ С ГЛЮТЕНОВОЙ ЭНТЕРОПАТИЕЙ

 Аннотация

Обследовано 36 больных псориазом с индексом PASI от 3 до 27 баллов, у которых была позитивная реакция при определение титра антител к эндомизию (ЭМА) класс IgA . При эндоскопическом и гистологическом анализе слизистой 12-ти перстной кишки выделены 3 группы больных псориазом и целиакией в зависимости от стадии целиакии; 1группа (n = 17)- инфильтративная стадия, 2 группа (n = 12) - гиперпластическая. 3 группа (n = 7) – атрофическая стадия. Увеличение количества CD68+ макрофагов в воспалительном инфильтрате слизистой 12-ти перстной кишки и коже в зависимости от стадии является важным моментом в понимании патогенеза аутоиммунного процесса при псориазе ассоциированном с глютеновой энтеропатией. Наличие межэпидермальных CD68+ макрофагов в атрофическую стадию является гистологической особенностью псориатического поражения кожи у больных с глютеновой энтеропатией.

Ключевые слова: псориаз, целиакия, макрофаги, иммунногистохимия

Yasser Khaled Abdel Karim Masadeh¹, Pritulo O.², Filonenko T.³

¹PhD, ²MD, ³associate professor, State Institution "Crimea State Medical University named after S.I. Georgievsky".

EXPRESSION PATTERNS OF CD68 MACROPHAGES IN SKIN AND MUCOUS MEMBRANES 12 DUODENAL ULCER OF PATIENTS WITH PSORIASIS ASSOCIATED WITH CELIAC DISEASE

Abstract

Patients by psoriasis associated with gluten enteropathy 36 is inspected patients by psoriasis with the index of PASI from 3 to 27 marks which had a positive reaction at determination of title of antibodies to endomisium (EMA) class of IGA. At the endoscopic and histological analysis of duodenum mucous membrane are selected 3 groups of patients by psoriasis and celiac disease depending of stage of celiac disease; 1group (n = 17) is the infiltrative stage, 2 group (n = 12) - hyperplastic. 3 group (n = 7) is the atrophy stage. Increase of amount of CD68 macrophages in inflammatory infiltration of duodenum mucous membrane and a skin is an important moment in understanding of pathogeny of autoimmune process at psoriasis associated with gluten enteropathy. A presence of interepidermal CD68 macrophages in atrophy stage is the histological feature of psoriasis defeat of skin at patients with gluten enteropathy.

Keywords: psoriasis, celiac disease, macrophage, immunohistochemistry

Связь болезней кожи с патологией кишечника известна давно. Особенно подробно изучены поражения кожи, ассоциированные с целиакией [1,9,10,11,15,17].

Глютенчувствительная целиакия или глютеновая энтеропатия (ГЭП) - заболевание тонкой кишки, обусловленное иммунным ответом на растительный белок глютен. Сложности диагностики ГЭП связаны с чрезвычайным разнообразием клинических проявлений от крайне тяжелого нарушения всасывания на фоне хронической диареи до малосимптомного течения или проявлением внекишечных симптомов, в том числе и псориаза [3,7,13,15,18].

Развитие иммунного ответа на глиадин при ГЭП определяется активацией иммунной системы, ассоциированной со слизистой оболочкой тонкой кишки . Парфенов А.И. предположил, что имеет место развитие двух вариантов развития иммунного ответа и формирования специфических антител в экстрацеллюлярном матриксе собственной пластинки слизистой оболочки тонкой кишки [3]. Первый путь осуществляется посредством макрофагов, захватывающих глиадин с последующей передачей информации Т– и В–лимфоцитам. Т–хелперы интенсивно экспрессируют антигены гистосовместимости НLА DR, активирующие рецепторы СD40L на В лимфоцитах и вызывают пролиферацию и дифференцировку плазматических клеток, продуцирующих антитела к глиадину. С другой стороны иммунный ответ на глиадин связан с образованием комплекса глиадина с тканевой трансглутаминазой, который обладает сродством к HLA DQ2 или HLA DQ8 на В–лимфоцитах и активизирует пролиферацию и дифференцировку плазматических клеток, которые синтезируют антитела к глиадину. Вновь образованный комплекс глиадина с ТТГ приводит к образованию антиглиадиновых антител, антител к ТТГ (АТТГ) и эндомизию. Дезаминированный глиадин активирует синтез провоспалительных цитокинов Т–лимфоцитами. Увеличение числа межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) – неспецифический ответ на повреждение эпителиоцитов – является самым ранним морфологическим проявлением целиакии [7,13,18,19,20].

Псориаз, как мультифакторное хроническое рецидивирующее заболевание, также имеет сходные звенья патогенеза с ГЭП и сопровождается развитием аутоиммунных реакций в коже, доказанное многочисленными исследователями [2,4,6,12,16]. Согласно этим данным псориаз рассматривается как аутоиммунное заболевание, которое может быть системным проявлением целиакии или ассоциированным с целиакией , так как повышение кишечной проницаемости тонкой кишки снижает барьерную функцию и позволяет токсинам проникать из кишечника сначала в гуморальную среду, а затем – в кожу с последующим появлением псориатических бляшек [10,11,15]. При этом антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки и макрофаги, высвобождают цитокины IL-12 и IL-23, которые активируют дифференциацию Th-клеток до форм Th1 и Th17. Эти клетки, в свою очередь высвобождают провоспалительные факторы, которое поддерживают воспаление, а также способствуют пролиферации кератиноцитов и эпителиоцитов [12,17].

Таким образом, учитывая общность патогенетических механизмов с развитием хронического аутоиммунного воспаления, участие макрофагов в регуляции экспрессии ко-стимулирующих молекул и продукцию ряда цитокинов, межклеточные взаимодействия, контролирующие антиген-специфическую активность Т-клеток, что определяет сценарий иммунного ответа при ГЭП и псориазе, целесообразно провести иммунногистохимическое исследование с моноклональными антителами CD68, описанных как маркер моноцитов/макрофагов. Определение количества и качества макрофагов в собственной пластинке слизистой 12-ти перстной кишки и псориатической бляшки является актуальным в понимании морфо- и патогенеза в зависимости от стадии ГЭП.

Цель – определение локализации иуровня СD68 макрофагов в коже и слизистой 12-ти перстной кишки у больных псориазом и глютеновой энтеропатией.

Материалы и методы исследования

Обследовано 36 больных псориазом с индексом PASI от 3 до 27 баллов, у которых скриннинговый анализ исследований для выявления целиакии показал позитивную реакцию при определение титра антител к эндомизию (ЭМА) класс IgA методом непрямой флюоресценции в сыворотке крови. Концентрация ЭМА колебалась от низких (1:40) до выраженных значений (1:160). Также проведена фибродуоденоскопия с последующим взятием биоптата слизистой ДПК для верификации диагноза.

Материал для исследования – биоптаты кожи и слизистой 12-ти перстной кишки. Каждый пациент получал подробную информацию о проводимом исследовании и давал информированное согласие на участие в исследовании. Диагностика и лечение больных псориазом проводилась в соответствии протоколу утвержденном приказом МОЗ Украины №312 от 08.05.2009 г.

Морфологическое исследование проводилось по стандартным методикам с окраской гематоксилином и эозином [8]. Иммуногистохимическое исследование (ИГХИ) проводилось на серийных парафиновых срезах в соответствии со стандартными протоколами [10], с использованием моноклональных антител CD68 (Clone PG-M1, разведение 1:50) и системы визуализации EnVision™ FLEX+, Mouse, High pH (Link), Code K8012 на автостейнере фирмы DAKO. В месте локализации антигена визуализировалась цитоплазматическая реакция коричневого цвета.

Морфометрическое исследование включало подсчет позитивных клеток в 3 полях зрения при увеличении 200. Полученные данные пересчитывали на 1 мм² среза. Просмотр и цифровые фотографии микропрепаратов осуществляли цифровой камерой OLYMPUS C 5050Z, установленной на микроскопе «Olympus CX-41».

Все полученные результаты подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы «MedStat» (серийный №MS0011) ДНПП ООО «Альфа», г. Донецк. При анализе проверки распределения на нормальность использовали Хи-квадрат и критерий W Шапиро-Уилка, сравнение центральных тенденций двух независимых выборок с использованием W-критерия Вилкоксона и сравнение средних двух независимых выборок по критерию Стьюдента. Для множественного сравнения непараметрических данных использовали ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса и критерий Дана [5].

Результаты и их обсуждение

Результаты гистологического исследования препаратов кожи и слизистой ДПК позволили выделить три группы больных псориазом ассоциированных с различными формами ГЭП соответствующих классификации Marsh [19]: инфильтративная стадия – 1 группа, гиперпластическая стадия – 2 группа и атрофичесая стадия – 3 группа.

Во всех препаратах обнаружены признаки хронического дуоденита слабой активности с наличием межэпителиальных лимфоцитов и сохранением структуры ворсин (n = 17); в 12 случаях (n = 12) отмечалась пролиферация энтероцитов крипт; в 7 случаях (n = 7)– атрофия ворсин с наличием выраженной лимфоидной инфильтрации в собственной пластинке слизистой ДПК и межэпителиальной зоне и строме.

С целью выявления количества и качества клеток макрофагальной генерации, являющихся одними из главных клеточных компонентов, участвующих в развитии аутоиммунного воспаления проведено иммунногистохимическое исследование с моноклональными антителами CD68, локализующихся в цитоплазме макрофагов.

Экспрессия CD68+ макрофагов обнаруживалась преимущественно в строме ворсинок и на границе с собственной пластинкой слизистой ДПК. При этом в контрольных срезах уровень экспрессии CD68+ макрофагов составил 2,1±0,54. В зависимости от стадии ГЭП (табл.1) уровень экспрессии достоверно изменялся в сторону увеличения. При инфильтративной стадии обнаруживали 12,24±11,19 клеток, при гиперпластической стадии - 19,12±11,28 и при атрофической - 25,14±12,56 (р <0,01). Следует отметить наличие единичных межэпителиальных макрофагов, которые достоверно не отличались в зависимости от стадии ГЭП. При инфильтративной стадии отмечалось 1,2±1,02 клеток, при гиперпластической 2,4±2,34, при атрофической стадии – 2,9±2,14 (р >0,01).

Результаты исследования гистологических препаратов из прогрессирующей псориатической бляшки у больных с ГЭП показали классическую морфологическую картину с наличием лимфоцитарной инфильтрации в дерме, пара- и гиперкератоз, акантоз эпидермиса и базальноклеточную пролиферацию эпидермоцитов, иногда абсцессы Мунро [2].

При иммуногистохимическом исследовании в контрольных срезах здоровой кожи экспрессия CD68+ макрофагов наблюдалась в верхнем слое дермы и составила 10,20±0,48 клеток.

В дермальном воспалительном инфильтрате в инфильтративной стадии  ГЭП отмечалось достоверное увеличение уровня экспрессии CD68+  макрофагов по отношению к контролю (13,71±1,01), в гиперпластической - 21,16±7,38 и атрофической - 27,68±11,59 (р <0,01) (табл.1).  Во всех группах вне зависимости от стадии ГЭП макрофаги фиксировались в зоне абсцесса Мунро. Обращает внимание появление межэпителиальных макрофагов только в атрофической стадии, что составило 2,4±2,46 позитивных CD68+  клеток (рис.1).

Рис. 1 - Фрагмент кожи. Атрофическая стадия ГЭП больного псориазом. Экспрессия CD68 +макрофагов, локализующихся в дерме и межэпидермальной области (стрелки). ИГХИ. Система визуализации FLEX. Ув. 40^х.

Таблица 1 - Уровень экспрессии CD68+ макрофагов в слизистой ДПК и коже у больных псориазом ассоциированном с ГЭП (M±m)

Примечание: * – достоверность отличия значений групп от контроля (P<0,01).

Таким образом, количество макрофагов в собственной пластинке слизистой 12-ти перстной кишки и дерме при псориазе ассоциированным с глютеновой энтеропатией увеличивается в зависимости от стадии ГЭП. Наиболее высокие показатели отмечаются в атрофическую стадию. Кроме того, в атрофическую стадию появляются межэпидермальные макрофаги, тогда как при инфильтративной и гиперпластической стадии таковые отсутствуют. По нашему мнению, увеличение количества макрофагов в строме и дерме, а также наличие межэпидермальных макрофагов свидетельствует о значимой роли повышенной секреции определенных цитокинов, что существенно дополняет ее патогенез и обеспечивает степень выраженности клинических проявлений.

Выводы

1. Увеличение количества CD68+ макрофагов в воспалительном инфильтрате слизистой 12-ти перстной кишки и коже является важным в понимании патогенеза аутоиммунного процесса при псориазе ассоциированном с глютеновой энтеропатией.
2. Наличие межэпидермальных CD68+ макрофагов в атрофическую стадию глютеновой энтеропатии свидетельствует о персистенции иммунного воспаления в коже больных псориазом и тяжести заболевания.

Перспективы дальнейшего развития

С учетом полученных данных о количестве и локализации CD68+ макрофагов в коже и 12-ти перстной кишке у больных псориазом с глютеновой энтеропатией необходимо изучить локализацию и количество CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов в воспалительном инфильтрате, определить иммунорегуляторный индекс и их взаимосвязь с макрофагальным компонентом.

Литература

1. Донцова О.В. Целиакия и дерматологические проявления: патологические процессы кожи – ключ к диагнозу «глютенчувствительная энтеропатия»/ О.В.Донцова // Сonsilium medicum Ukraina. – 2013.–Т. 7, №6.– С.3–5
2. Катунина О.Р. Иммуноморфологическая характеристика клеток воспалительного инфильтрата при псориазе / О.Р. Катунина // Вестник дерматологии и венерологии. –2005. –№2. –С.25-28.
3. Килесса А.В. Комплексная морфологическая диагностика глютеновой энтеропатии /А.В. Килесса//дис. К.н., Симферополь – 2012.– 167с.
4. Коляденко К. В. Псоріаз. нові можливості виправдати надії / К. В. Коляденко // Український журнал дерматології, венерології та косметології. – 2007. – № 4. – C. 101.
5. Лапач С.Н. Статистические методы в медико-биологических исследованиях / С.Н.Лапач, А.В.Чубенко, П.Н.Бабич // К. – Морион – 2000 – 319с.
6. Новиков А.И. Состояние популяции мононуклеарных фагоцитов (CD68) в псориатической папуле под влиянием Тимодепрессина / А.И. Новиков, В.А. Охлопков, Р.В. Городилов, и др. // Клиническая дерматология и венерология. – 2006. – №3. – С.30-32.
7. Парфенов А.И. Целиакия. Эволюция представлений о распространенности, клинических проявлениях и значимости этиотропной терапии /А.И. Парфенов// М.: Анахарсис.– 2007. – 372с.
8. Сапожников А.Г. Гистологическая и микроскопическая техника: Руководство. / А.Г. Сапожников, А.Е. Дорошевич// Смоленск: САУ, 2000. – 476 с.
9. Admou B. Atypical celiac disease: from recognizing to managing /B.Admou, L.Essaadouni, K.Krati [et al.] // Gastroenterol. Res. Pract.– 2012. –№63. – Р.71–87.
10. Abenavoli L. Celiac disease and skin: psoriasis association/ L.Abenavoli, L.Leggio, G.Gasbarrini, [et al.] // World J Gastroenterol. –2007. – №13. – Р.2138–2139.
11. Birkenfeld S. Coeliac disease associated with psoriasis / S.Birkenfeld, J.Dreiher, D.Weitzaman [et al.] //. Br J Dermatol. –– № 161.– Р.1331–1334.
12. Bos J.D. Immunocompetent cells in psoriasis. In situ immunophenotyping by monoclonal antibodies / J.D.Bos, H.J.Hulsebosch, S.R. Krieg et al. // Arch. Dermatol. Res. – 1983. – Vol.275. –P.181-189.
13. Celiac Disease: WGO-OMGE Practice Guideline // World Gastroenterology Organisation [Electronic resource]. – 2005 – Mode of access:http://www.omge.org/globalguidelines/guide13/ guideline13.htm.
14. Dabbs D.J. Diagnostic immunohistochemistry / Dabbs D.J.// London: Churchill Livingstone, 2006. – 828 p.
15. Damasiewicz-Bodzek A. Serological markers of celiac disease in psoriatic patients /A.Damasiewicz-Bodzek, T.Wielkosszynski // Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. – 2008.– №9(22).– Р.1055–1061.
16. Čabrijan Leo. Crowth CD4 and CD8 lymphocytes and macrophages in psoriasis / Leo Čabrijan, Jasna Lipozenčić, Tanja Batinac, et al.// Acta Dermatovenerology. – 2009. – Vol. 17, № 3. – С.162-165.
17. Ludvigsson F. Psoriasis in a nationwide cohort study of patients with celiac disease / J.F.Ludvigsson, B.Lindelöf, F.Zingone [et al.] // J Invest Dermatol. – 2011.– №131(10).– Р.2010–2016.
18. Lionetti E. New clues in celiac disease epidemiology, pathogenesis, clinical manifestations, and treatment / E.Lionetti, C.Catassi // Int. Rev. Immunol. –2011. – № 30(4). – Р.219–321.
19. Marsh M.N. Morphology of the mucosal lesion in gluten sensitivity / M.N. Marsh, Р.Т. Crowe // Baillieres Clin. Gastroenterol. – 1995. – Vol. 9, № 2. – P. 273-93.
20. Sapone A. Spectrum of gluten-related disorders: consensus on new nomenclature and classification / A.Sapone, J.C.Bai, C.Ciacci [et al.] // BMC Med. – 2012.– №7. – Р. 10 – 13.

References

1. Doncova O.V. Celiakija i dermatologicheskie projavlenija: patologicheskie processy kozhi – kljuch k diagnozu «gljutenchuvstvitel'naja jenteropatija»/ O.V.Doncova // Sonsilium medicum Ukraina. – 2013.–T. 7, №6.– S.3–5.
2. Katunina O.R. Immunomorfologicheskaja harakteristika kletok vospalitel'nogo infil'trata pri psoriaze / O.R. Katunina // Vestnik dermatologii i venerologii. –2005. –№2. –S.25-28.
3. Kilessa A.V. Kompleksnaja morfologicheskaja diagnostika gljutenovoj jenteropatii /A.V. Kilessa//dis. K.n., Simferopol' – 2012.– 167s.
4. Koljadenko K. V. Psorіaz. novі mozhlivostі vipravdati nadії / K. V. Koljadenko // Ukraїns'kij zhurnal dermatologії, venerologії ta kosmetologії. – 2007. – № 4. – C. 101.
5. Lapach S.N. Statisticheskie metody v mediko-biologicheskih issledovanijah / S.N.Lapach, A.V.Chubenko, P.N.Babich // K. – Morion – 2000 – 319s.
6. Novikov A.I. Sostojanie populjacii mononuklearnyh fagocitov (CD68) v psoriaticheskoj papule pod vlijaniem Timodepressina / A.I. Novikov, V.A. Ohlopkov, R.V. Gorodilov, i dr. // Klinicheskaja dermatologija i venerologija. – 2006. – №3. – S.30-32.
7. Parfenov A.I. Celiakija. Jevoljucija predstavlenij o rasprostranennosti, klinicheskih projavlenijah i znachimosti jetiotropnoj terapii /A.I. Parfenov// M.: Anaharsis.– 2007. – 372s.
8. Sapozhnikov A.G. Gistologicheskaja i mikroskopicheskaja tehnika: Rukovodstvo. / A.G. Sapozhnikov, A.E. Doroshevich// Smolensk: SAU, 2000. – 476 s.
9. Admou B. Atypical celiac disease: from recognizing to managing /B.Admou, L.Essaadouni, K.Krati [et al.] // Gastroenterol. Res. Pract.– 2012. –№63. – Р.71–87.
10. Abenavoli L. Celiac disease and skin: psoriasis association/ L.Abenavoli, L.Leggio, G.Gasbarrini, [et al.] // World J Gastroenterol. –2007. – №13. – Р.2138–2139.
11. Birkenfeld S. Coeliac disease associated with psoriasis / S.Birkenfeld, J.Dreiher, D.Weitzaman [et al.] //. Br J Dermatol. –– № 161.– Р.1331–1334.
12. Bos J.D. Immunocompetent cells in psoriasis. In situ immunophenotyping by monoclonal antibodies / J.D.Bos, H.J.Hulsebosch, S.R. Krieg et al. // Arch. Dermatol. Res. – 1983. – Vol.275. –P.181-189.
13. Celiac Disease: WGO-OMGE Practice Guideline // World Gastroenterology Organisation [Electronic resource]. – 2005 – Mode of access:http://www.omge.org/globalguidelines/guide13/ guideline13.htm.
14. Dabbs D.J. Diagnostic immunohistochemistry / Dabbs D.J.// London: Churchill Livingstone, 2006. – 828 p.
15. Damasiewicz-Bodzek A. Serological markers of celiac disease in psoriatic patients /A.Damasiewicz-Bodzek, T.Wielkosszynski // Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. – 2008.– №9(22).– Р.1055–1061.
16. Čabrijan Leo. Crowth CD4 and CD8 lymphocytes and macrophages in psoriasis / Leo Čabrijan, Jasna Lipozenčić, Tanja Batinac, et al.// Acta Dermatovenerology. – 2009. – Vol. 17, № 3. – С.162-165.
17. Ludvigsson F. Psoriasis in a nationwide cohort study of patients with celiac disease / J.F.Ludvigsson, B.Lindelöf, F.Zingone [et al.] // J Invest Dermatol. – 2011.– №131(10).– Р.2010–2016.
18. Lionetti E. New clues in celiac disease epidemiology, pathogenesis, clinical manifestations, and treatment / E.Lionetti, C.Catassi // Int. Rev. Immunol. –2011. – № 30(4). – Р.219–321.
19. Marsh M.N. Morphology of the mucosal lesion in gluten sensitivity / M.N. Marsh, Р.Т. Crowe // Baillieres Clin. Gastroenterol. – 1995. – Vol. 9, № 2. – P. 273-93.
20. Sapone A. Spectrum of gluten-related disorders: consensus on new nomenclature and classification / A.Sapone, J.C.Bai, C.Ciacci [et al.] // BMC Med. – 2012.– №7. – Р. 10 – 13.