INFLUENCE OF COLLOIDAL SILVER NANOPARTICLE SOLUTION ON PHYTOPATHOGENIC FUNGI P. BIPOLARIS

Возбудитель обыкновенной корневой гнили зерновых фитопатогенный гриб Bipolaris sorokiniana является одним из распространенных возбудителей корневых гнилей, листовой пятнистости и «черного зародыша» зерновых культур во всех основных зернопроизводящих регионах мира

До настоящего времени основным методом борьбы с вызываемыми B. sorokiniana обыкновенной корневой гнилью зерновых и «черным зародышем» являлся химический метод, заключающийся в протравливании семенного материала фунгицидами. Однако в последние десятилетия наблюдается повсеместное распространение резистентных к фунгицидам штаммов фитопатогенных грибов

Цель работы – изучить влияние коллоидного раствора НЧ Ag на фитопатогенный гриб Bipolaris sorokiniana.

Объектом исследования служил коллоидный раствор (золь) НЧ Ag, изготовленный Отделом молекулярной электроники Федерального исследовательского центра «Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук» (ОМЭ ФИЦ КНЦ СО РАН). Коллоидный раствор (золь) НЧ Ag при комнатной температуре в тёмном месте стабилен в течение 1 года.

По данным разработчиков, содержание серебра в растворе составляет 50 мг/л. Основная доля наночастиц имеет размеры от 4 до 12 нм, хотя встречаются отдельные частицы размером до 25 нм, а также агрегаты наночастиц (рис. 1).

Рисунок 1 - Гистограмма распределения наночастиц серебра по размерам

DOI:10.60797/IRJ.2024.150.40.1

В качестве тест-культуры для проверки биологических свойств исследуемого коллоидного раствора НЧ Ag (разбавляли непосредственно перед применением) использовали моноконидиальный изолят возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых B. sorokiniana, выделенный из поражённой корневой гнилью пшеницы, выращенной в учебно-научном комплексе (УНПК) «Борский» (56°26′15″ с. ш. 92°54′11″ в. д.) ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ.

Проверку фунгицидных свойств препарата проводили с помощью теста, основанного на прорастании конидий

Для получения конидий гриб выращивали в течение 14 сут. при 25 ± 1ºC на агаризованной среде Чапека-Докса следующего состава (г/л): сахароза – 20,0 г/л; нитрат натрия – 2,0 г/л; фосфат калия двузамещенный – 1,0 г/л; сульфат магния – 0,5 г/л; хлорид калия – 0,5 г/л; сульфат железа – 0,01 г/л; агар – 20,0 г/л; рН 7,3±0,2. В качестве индуктора прорастания конидий использовали сахарозу

В ячейки с помощью микропипет-дозатора вносили по 20 мкл суспензии конидий в смеси с разными концентрациями раствора наночастиц, после чего инкубировали во влажной камере при температуре 26ºС в течение 6 часов. По окончании инкубирования подсчитывали число проросших и непроросших конидий, а также измеряли длину проростковых гиф. Подсчёт проросших и непроросших конидий, а также измерение длины проростковых гиф проводили по микрофотографиям набора полей зрения. Микрофотографии выполняли с помощью микроскопа Микмед-6 вар. 3, оснащённого цифровой USB-камерой DCM-13E. Измерение гиф выполняли с помощью распространяемой без лицензионных ограничений в качестве общественного достояния программы ImageJ, разработанной сотрудниками National Institutes of Health Департамента здравоохранения Соединённых Штатов Америки.

Первоначальный эксперимент выполняли со свежеприготовленным коллоидным раствором наночастиц серебра. Для проверки стабильности биологических свойств исследуемого раствора был проведён повторный эксперимент с тем же образцом раствора после 2,5 месяца его хранения в закрытой таре в темноте при комнатной температуре. В первом эксперименте набор концентраций наночастиц получали последовательным разведением исходного раствора в 2, 4, 8 и 16 раз. Во втором эксперименте, с целью уточнения кривой «доза-эффект» на малых концентрациях – последовательным разведением в 2, 4, 8, 16, 32, 64 и 128 раз Контролем служила суспензия конидий без добавления наночастиц.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica (версия 6, Statsoft) и MS Excel 2007 для Windows.

Прорастание конидий в контроле после 6 ч инкубирования составило 30,8%. Прорастание в коллоидном растворе НЧ Ag в диапазоне концентраций от 12,5 до 50% от исходного раствора было ниже, чем в контроле, хотя статистическая значимость эффекта доказана только для концентраций 25 и 50 % (табл. 1).

Кроме прорастания конидий, НЧ Ag оказали ингибирующее влияние на рост проростковых гиф B. sorokiniana (рис. 2).

Рисунок 2 - Характерный размер проростковых гиф B. sorokiniana после 6 часов инкубирования в контроле (1) и в присутствии наночастиц серебра в концентрации 50% от исходной (2)

Примечание: конидии обозначены жёлтыми точками, проростковые гифы – стрелками

DOI:10.60797/IRJ.2024.150.40.3

Дисперсионный анализ подтвердил статистическую значимость влияния НЧ Ag на рост проростковых гиф на уровне p < 0,05 с показателем силы влияния 10,7%. Ингибирующий эффект наночастиц на рост проростковых гиф проявился в концентрациях 50 и 12,5%. С учётом того, что в растворе присутствуют частицы разного размера, можно предположить, что эти эффекты обусловлены действием частиц разного размерного класса.

Кроме этого, НЧ Ag оказали негативное влияние на максимальную длину проростковых гиф, в том числе – в минимальной изученной концентрации. В первом приближении эффект описывается линейным уравнением (коэффициент детерминации R2 = 0,793, коэффициент корреляции r=-0,891, статистическая значимость регрессии p < 0,05), однако зависимость максимальной длины от концентрации наночастиц носит ярко выраженный нелинейный характер.

Можно предположить, что нелинейный характер эффекта, как и в случае средней длины проростковых гиф, связан с наличием в растворе наночастиц разного размерного класса с разными кривыми доза-эффект. В таком случае наблюдаемая зависимость является результатом наложения двух дозовых кривых.

Кроме влияния на среднюю и максимальную длину проростковых гиф, наночастицы серебра снизили такие показатели варьирования, как коэффициенты вариации и осцилляции. Особенно ярко эффект проявился в отношении коэффициента осцилляции.

Одной из важных проблем при использовании коллоидных растворов наночастиц является изменение их свойств в процессе хранения – как за счёт агрегации частиц, так и за их счёт окисления

В этой связи нами было проведено изучение влияния исследуемых НЧ Ag на прорастание конидий после 2,5 мес. хранения. Установлено, что прорастание конидий в контроле составило в среднем 51,3%. Прорастание в вариантах с НЧ Ag варьировало от 34,8% (при разведении исходного раствора наночастиц в 2 раза) до 58,0% (при разведении исходного раствора в 128 раз). Статистическая значимость влияния НЧ Ag длительного хранения на прорастание конидий B. sorokiniana доказана только для концентрации 50% от исходного раствора. Это влияние проявилось в снижении прорастания конидий в 1,5 раза относительно контроля. На этой же концентрации отмечено статистически значимое (p < 0,05) ингибирование роста проростковых гиф в сравнении с контрольными вариантами.

Следует отметить, что отсутствие статистической значимости эффекта не означает отсутствия эффекта. Отсутствие статистической значимости означает лишь то, что эффект при использовании данного конкретного статистического теста не доказан. Для уточнения наличия эффектов наночастиц были построены кривые «доза-эффект» (рис. 3).

Рисунок 3 - Прорастание конидий в разных вариантах эксперимента: 

А – к «Контролю 1» (контроль с 1 % сахарозы); Б – к «Контролю 2» (контроль с 2 % сахарозы); В – к «Контролю 1+2» (контроль, составленный из объединённых данных «Контроля 1» и «Контроля 2»)

DOI:10.60797/IRJ.2024.150.40.4

При анализе полученных кривых обращает на себя внимание явно двувершинный характер зависимости прорастания конидий от концентрации наночастиц. Возможно, что биологический эффект исследуемого коллоидного раствора обусловлен частицами разных (как минимум – двух) размерных классов, для каждого из которых характерна своя кривая «доза-эффект», а наблюдаемая зависимость является наложением этих кривых.

С учётом этого предположения, для проведения регрессионного анализа кривая «доза-эффект» была разбита на два диапазона: диапазон концентраций частиц от 0,78125 до 6,25% от исходного раствора, и диапазон концентраций от 6,25% до 50% от исходного раствора.

В диапазоне от 0,78125% до 6,25% зависимость прорастания конидий от концентрации частиц носит экспоненциальный характер с нисходящим трендом.

Экспериментальные и теоретические значения прорастания конидий B. sorokiniana в присутствии НЧ Ag длительного хранения в диапазоне концентраций от 6,25 до 50% от исходного раствора; теоретические значения рассчитаны по уравнению; точка с концентрацией 0 % введена путём экстраполяции:

(1)

В присутствии наночастиц в области концентраций 6,25 – 3,125% от исходного раствора отмечено аномальное прорастание конидий B. sorokiniana в виде «пузырьков», образующихся вместо нормальной проростковой гифы (рис. 4, слева). В ряде случаев подобные структуры имели многоклеточное строение (рис. 4, справа). Можно предположить, что подобные аномалии связаны с действием исследуемых наночастиц, хотя наличие эффекта и его механизмы нуждаются в дальнейшем изучении.

Рисунок 4 - Аномальное прорастание конидий B. sorokiniana в присутствии НЧ Ag длительного хранения в концентрации 6,25% от исходного раствора

Примечание: аномальные структуры в виде «пузырьков» показаны стрелками

DOI:10.60797/IRJ.2024.150.40.5

Таким образом, можно констатировать, что исследуемый коллоидный раствор НЧ Ag обладает ярко выраженной биологической активностью в отношении возбудителя обыкновенной корневой гнили зерновых B. sorokiniana. В высоких концентрациях эта активность проявляется в виде ингибирования прорастания конидий и роста проростковых гиф. В малых концентрациях отмечается небольшой стимулирующий эффект.

Исследуемые наночастицы в концентрациях 50 и 25% от исходного раствора, что соответствует 25 и 12,5 мг/л серебра, статистически значимо (p<0,01) ингибируют прорастание конидий соответственно в 3,1 и 2,3 раза относительно контроля.

НЧ Ag в диапазоне концентраций от 6,25% до 50% от исходной концентрации статистически значимо (p<0,05) снижают максимальную длину проростковой гифы. Наночастицы статистически значимо (p<0,05) влияют на среднюю длину проростковой гифы. Это влияние варьирует от снижения средней длины проростковых гиф в 1,7 раз относительно контроля при использовании наночастиц в концентрации 50% от исходного раствора, до увеличения средней длины проростковых гиф в 1,3 раза относительно контроля при использовании наночастиц в концентрации 6,25% от исходного раствора.

Антигрибная активность НЧ Ag сохраняется при хранении в течение 2,5 месяцев, хотя и несколько ослабевает. После хранения раствора статистически значимое (p<0,01) ингибирование прорастания конидий (в 1,5 раза относительно контроля) сохраняется для концентрации 50% от исходной.

Экспериментальные кривые, описывающие зависимость прорастания конидий и рост проростковых гиф от концентрации наночастиц, носят ярко выраженный нелинейный характер. Анализ этих кривых позволяет с высокой степенью уверенности предположить, что биологические свойства исследуемого раствора обусловлены суммированием независимых эффектов наночастиц как минимум двух размерных классов, для каждого из которых характерна своя дозовая кривая.