ADHESIVE ACTIVITY OF CLINICAL MICROBIAL ISOLATES OF MICROORGANISMS OF INDIVIDUALS SEROPOSITIVE TO TOXOCARIASIS UNDER IN VITRO CONDITIONS
ADHESIVE ACTIVITY OF CLINICAL MICROBIAL ISOLATES OF MICROORGANISMS OF INDIVIDUALS SEROPOSITIVE TO TOXOCARIASIS UNDER IN VITRO CONDITIONS
Abstract
The surface of the larvae of some helminths, possessing a large adsorption area, can serve as one of the factors of accumulation and persistence of microorganisms in the host organism on the one hand. On the other hand, the highly adhesive properties of strains contribute to the accumulation of microorganisms on the surface of the larva, which may also serve as an additional etiological factor in the development of infectious pathological process. In the study, the primary adhesion indices of strains to Toxocara canis nematode larvae isolated from Toxocara seropositive individuals (Apti-Toxocara IgG+) were evaluated. The results of the experiment showed highly adhesive activity of clinical isolates of strains isolated from toxocarosis seropositive patients.
1. Введение
Инвазирование организма человека паразитическими нематодами происходит, главным образом, при попадании инвазионных яиц с частичками почвы, контаминированной растительной пищей или с шерстью поражённых домашних животных
, . В макроорганизме гельминты претерпевают ряд изменений в ходе которых формируется инвазионная личинка, способная к миграции в тканях и с током крови , . Пищеварительный тракт считается крупнейшим резервуаром бактерий, плотность которых увеличивается от проксимальных отделов к дистальным , . В результате паразитарной инвазии, напрямую или опосредованно через влияние на регуляторные звенья иммунной системы, происходит изменение бактериального сообщества кишечника , , . Личинки некоторых гельминтов, мигрируя с током крови, способны адсорбировать на поверхности микроворсинок кутикулы или в пределах своего организма бактерии в виде скоплений , . Резервирование микроорганизмов личинками и их транспорт в отдалённые от места патологического процесса органы и ткани может способствовать качественным и количественным изменениям микробного сообщества биотопов последних, с развитием инаппарантных форм инфекционно-инвазионного процесса у человека. В организме животных происходит инокуляция стенок кишечника хозяина патогенными и условнопатогенными микроорганизмами, при условии их адсорбции на поверхности личиночной формы нематоды, что приводит к развитию острых септических состояний .Изучение явления персистенции патогенных микроорганизмов в личинках мигрирующих нематод осуществлялось только в рамках ветеринарной микробиологии
, , , . Третьяков А.М. констатировал факт так называемого «микробного носительства» некоторыми возбудителями паразитарных инвазий, что способствует дальнейшей реализации их персистенции в макроорганизме. Элементы накопления микроорганизмов в складках эпикутикулы и пищеварительной системе нематод при их миграции с током крови могут расцениваться как этиологические факторы возникновения инфекционных заболеваний . Моделирование процесса адгезии микроорганизмов и грибов на поверхности личинок нематод ранее не проводилось.Цель исследования – Изучение адгезивных свойств клинических изолятов S.aureus и грибов рода Candida, выделенных от серопозитивных к T.canis лиц, по отношению к биологическому субстрату в условиях invitro.
2. Методы и принципы исследования
Исследования проводились на базе научной лаборатории кафедры микробиологии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. В качестве материала использовали различные культуры микроорганизмов, выделенные от обследуемых с аnti-Toxocara IgG+: коагулазопозитивные S.aureus, грибы рода Candida.
В качестве биологического субстрата применяли живые личинки нематоды Toxocara canis III стадии. Личинки гельминтов получали после длительного культивирования инвазионных яиц в питательном субстрате с ежедневным контролем их жизнеспособности
.Из суточной бульонной культуры, полученной на скошенном питательном агаре, смывали 5 мл инокулята забуференным физиологическим раствором (0,15 М) с последующим двухкратным центрифугированием при 1500 об/мин (RCF= 314g) в течение 10 минут. Далее готовили суспензию бактерий, количество которых составляло 2х109 КОЕ/мл по стандарту оптической мутности 0,5 Мак-Фарланда (1 ЕД McF по стандарту мутности McFarland); грибов рода Candida — 105 КОЕ/мл.
Иммобилизацию бактерий на поверхности личинок осуществляли в асептических условиях. Для этого в стерильных центрифужных пробирках смешивали взвесь личинок и исследуемых штаммов в эквивалентном объёме: 0,5 мл инокулюма и 0,5 мл взвеси личинок с последующим инкубированием образцов в условиях термостата при 370С в течение 30 минут, 1 и 2 часов (образец №1, №2, №3).
В качестве контроля использовали нативную суспензию личинок в физиологическом растворе.
По истечении времени инкубации образцов освобождали смесь от неиммобилизированных микроорганизмов трёхкратным центрифугированием в буферном растворе при величине RCF= 50g (600 об/мин) в течение 10 минут. В асептических условиях по 1 мл полученного супернатанта каждого образца вносили в чашки Петри, равномерно заливали расплавленным и остуженным питательным агаром. Аналогичные манипуляции проводили с использованием среды Сабуро для культивирования дрожжеподобных грибов рода Candida. Для получения статистически достоверных результатов каждый опыт повторяли трёхкратно. Посевы инкубировали в условиях термостата при 37 0С с учётом питательных потребностей, также в обычных условиях при комнатной температуре — для дрожжеподобных грибов.
Макроскопическое изучение колоний осуществляли при помощи стереомикроскопа МБС-10М с определением их количества, выраженного в колониеобразующих единицах на 1 мл (КОЕ/мл). В контрольных образцах роста выявлено не было. Полученные данные переводили в десятичные логарифмы степени микробной адгезии и рассчитывали индекс адгезии для каждого тест-штамма согласно методике, предложенной В. Н. Царёвым с некоторыми модификациями
:Ia= lgA/lgN,
где Ia – индекс первичной адгезии; A – количество бактерий, адсорбированных на субстрате; N – исходное количество бактерий смеси (109). Далее формировали собственную шкалу показателей адгезии. Уровни адгезии отдельных штаммов бактерий (грибов) условно дифференцировали на 4 степени активности: неадгезивные (Ia=0); низкоадгезивную (Ia=0,25-0,93); среднеадгезивную (Ia = 1,02-1,29); высокоадгезивную (Ia = 1,31-1,75).
Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v. 3.1.8 (разработчик – ООО "Статтех", Россия). Достоверность различия показателей оценивали в соответствии с t-критерием Стьюдента, при P < 0,05.
3. Основные результаты
Степень адгезии оценивали индексом адгезии, полученным при вычислении частного от среднего количества бактерий адсорбировавшихся на субстрате, и количества бактерий не прикрепившихся к нему. Неадгезивными считали штаммы с индексом адгезии Ia = 0, низкоадгезивными – Ia =0,25-0,93; среднеадгезивными с Ia = 1,02-1,29; высокоадгезивными при Ia = 1,31-1,75. В ходе исследования адгезивных свойств изучаемых культур (12 штаммов), были выявлены различия в адгезивной способности штаммов бактерий и грибов рода Candida в зависимости от времени экспозиции инкубационной смеси. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Показатели адгезии испытуемых образцов
Время экспозиции взвеси при t 370C | Грибы рода Candida, M±m
| Staphylococcus spp., M±m
|
Контроль | Отсутствие роста | Отсутствие роста |
30 мин | Отсутствие роста | Единичные колонии |
1 час | 0,8±0,09** | 1,09±0,07 |
2 часа | 1,33±0,03* | 1,32±0,09* |
Примечание: * — показатели адгезии достоверно выше по сравнению с образцами при 60 мин экспозицией, (P < 0,05)-t-критерий Стьюдента для связанных совокупностей; ** — показатели адгезии грибов рода Candida достоверно ниже по сравнению с образцами стафилококков при 60 мин экспозиции
Адсорбция микроорганизмов на поверхности личинок происходит за счёт ионного и электростатического взаимодействия. Такой способ иммобилизации наиболее оптимален для живых клеток
. Согласно полученным результатам, степень адгезивной способности микроорганизмов изменяется при увеличении времени экспозиции, при котором происходит взаимодействие между субстратом (личинкой) и микроорганизмами. Ввиду короткого времени экспозиции инкубационной смеси, в образцах под №1 выявлялись наименьшие показатели адгезии или адгезия не выявлялась.Средние показатели адгезии Staphylococcus spp. при инкубации смеси в течение 1 и 2 часов составили 1,09±0,07 и 1,32±0,09 условных единиц соответственно. Выявлено статистически значимое изменение значений показателей адгезии штаммов к различным образцам в соответствии с временем экспозиции, что указано в таблицах 1-2 (P < 0,05).
Таблица 2 - Результаты корреляционного анализа взаимосвязи показателей адгезии Staphylococcus spp
Показатель | Характеристика корреляционной связи | ||
Ρ | Теснота связи по шкале Чеддока | p | |
Staph. 1 час – Staph. 2 часа | 0,641 | Заметная | 0,025 |
Примечание: * – различия показателей статистически значимы (p < 0,05)
Максимальные показатели адгезии отмечаются у Staphylococcus spp. при двухчасовой экспозиции практически у всех штаммов, их значения составляют 1,39-1,75 (в среднем 1,32±0,09) условных единиц.
Показатели адгезии грибов рода Candida к биологическому субстрату были умеренно выражены для всех образцов, что отображено на сравнительной диаграмме 1 (рис. 1). Показатели адгезии варьировали от 0.55 до 1.43 условных единиц при максимальном значении 1,53. Штаммы Staphylococcus spp. и Candida spp. следует отнести к группе высокоадгезивных согласно разработанной шкале. При этом, данные достоверно ниже таковых показателей для стафилококков при одинаковом времени инкубации смеси (p < 0,05). Средние значения показателя адгезии составили 1,33±0,03 и 0,8±0,09 при двухчасовой и 60 минутной экспозиции соответственно.
Рисунок 1 - Сравнительная характеристика тест-штаммов грибов рода Candida и Staphylococcus spp. при разном времени инкубации смеси
Оценка взаимосвязи между показателями адгезии установила прямую корреляционную связь. При увеличении времени экспозиции смеси на час, следует ожидать увеличение показателей адгезии испытуемых штаммов. Результаты исследований показали, что исследуемые штаммы отличаются степенью адгезии к биологическому субстрату и относятся к категории микробов с высокоадгезивными свойствами. Максимальные показатели адгезии отмечаются у Staphylococcus spp. при двухчасовой экспозиции практически у всех штаммов. Поверхность личинок гельминтов, обладая большой адсорбционной площадью, может служить одним из факторов накопления и персистенции микроорганизмов в организме хозяина с одной стороны. С другой стороны, высокоадгезивные свойства штаммов обеспечивают скопление бактерий/грибов на поверхности личинки, что также может послужить дополнительным этиологическим фактором развития инфекционного патологического процесса.
4. Заключение
В период миграции личинки травмируют ткани и кровеносные сосуды, вызывая развитие некротических и воспалительных явлений в области инокуляции, дополнительная микробная нагрузка поверхности личинок приводит к формированию длительного очага воспаления и развитию хронических форм инфекции. Таким образом, изучение адгезивных свойств штаммом к элементам эпикутикулы нематод наиболее актуально при мигрирующих формах паразитарных инвазий.