Bactericidal Properties of Essential Oils against Bird Respiratory Pathogens
Bactericidal Properties of Essential Oils against Bird Respiratory Pathogens
Abstract
The bactericidal activity of essential oils of fir, hyssop, coriander, geranium, pine, mint, sage, cedar, juniper, rosemary, cypress, mountain lavender, eucalyptus was studied, produced by Alushta essential oilseed state farm on the territory of the Republic of Crimea of the Russian Federation against some pathogens of respiratory diseases of birds of bacterial etiology – Salmonella enteritidis, Starchylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.
During the experiment, it was established that the test culture of Pseudomonas aeruginosa by the well method was resistant to most of the essential oils and showed sensitivity to only two essential oils – cypress and eucalyptus. Against Staphylococcus aureus, all tested oils, except sage, had high bactericidal activity. The greatest zone of E. coli growth inhibition was formed by oils of coniferous plants – fir, cypress and cedar. With respect to Salmonella enteritidis, essential oils of coniferous plants – fir, cypress, pine and cedar were also more effective than other oils.
Vapours of essential oils of coriander, fir, hyssop, geranium, peppermint and mountain lavender completely inhibited the growth of Staphylococcus aureus. Eucalyptus, hyssop and coriander essential oil vapours had an effect on the growth of Pseudomonas aeruginosa, significantly reducing it by 7.6, 5.5 and 7.2 times respectively. The growth of E. coli was completely inhibited by coriander and fir essential oil vapours. A sample of cedar essential oil completely suppressed the growth of Salmonella enteritidis.
1. Введение
Респираторный синдром у птиц является одним из наиболее часто встречаемых симптомокомплексов. Одной из причин этому может быть патогенная и условно-патогенная бактериальная микрофлора. Поражения респираторных органов могут вызывать возбудители бактериальных инфекций – пастереллеза, орнитобактериоза, гемофилеза, микоплазмоза, хламидиоза, сальмонеллеза, колибактериоза, псевдомонноза, стафилококкоза, стрептококкоза и другие . Болеют птицы всех видов и возрастов. Основной путь заражения – аэрогенный. Полиэтиологичность болезней респираторного тракта и многофакторность их патогенеза обязывают проводить тщательную бактериологическую диагностику и, при разработке комплексных рекомендаций, предусматривать как специфические, так и неспецифические методы профилактики данной патологии.
Для лечения и профилактики бактериальных болезней птиц широко применяется антибиотикотерапия. Однако последнее время при бактериологическом исследовании птиц все чаще выделяются устойчивые к широкому спектру антибиотиков и химиопрепаратов штаммы микроорганизмов . Распространение таких штаммов усложняет контроль бактериальных инфекций. В связи с этим актуальным и значимым в настоящее время является поиск новых средств и методов борьбы с респираторными болезнями птиц бактериальной этиологии в промышленном птицеводстве.
Перспективным средством для решения этой проблемы могут стать биологически активные вещества растительного происхождения, в частности эфирные масла .
Эфирные масла, как антибиотические средства, известны очень давно. Это ароматические жидкости, получаемые из растительных материалов. По химической структуре они являются производными терпенов и их кислородосодержащих соединений – терпеноидов. Взаимодействуя с белками, они дестабилизируют ферментные системы, нарушают митохондриальную активность, разрушают окислительное фосфорилирование и тормозят образование макроэргических связей. Наличие терпеноидов, входящих в их состав, обусловливает выраженный бактерицидный эффект , . В состав эфирных масел также входят спирты, альдегиды, кетоны, простые и сложные эфиры, кислоты и другие соединения. Они обладают широким спектром антимикробного, антифунгального и антивирусного действия, являются иммуномодуляторами и стимулируют обменные процессы в организме животных .
Эфирные масла могут быть использованы для борьбы с антибиотико-резистентными микроорганизмами, так как не обладают мутагенными свойствами и не приводят к образованию морфологически-измененных форм бактерий, поэтому не вызывают устойчивости у микроорганизмов .
В последнее время появилось большое разнообразие препаратов на основе растительных компонентов. Эфирные масла входят в некоторые кормовые добавки, с их помощью проводят дезинфекцию инкубационного яйца , их используют для снятия теплового стресса птиц, вносят в пробиотические препараты. Установлено иммуномодулирующее действие фитопрепарата на основе эфирных масел при вакцинации , .
Целью нашей работы было исследовать бактерицидные свойства эфирных масел в отношении некоторых возбудителей респираторных болезней птиц бактериальной этиологии.
2. Методы и принципы исследования
В качестве материала для исследований использовали эфирные масла: пихты, иссопа, кориандра, герани, сосны, мяты, шалфея, кедра, можжевельника, розмарина, кипариса, горной лаванды, эвкалипта, произведенных из собственного сырья Алуштинским эфиромасличным совхоз-заводом на территории Республики Крым РФ.
В опытах in vitro методом лунок установили, обладают ли данные виды масел бактерицидной активностью в отношении возбудителей респираторных болезней птиц – Salmonella enteritidis, Staphуlococcus aureus, Esсherichia coli, Pseudomonas aeruginosa – музей рабочих культур отдела микробиологии ВНИВИП. Перед проведением экспериментов все описанные музейные штаммы освежали и подтверждали их культуральные, тинкториальные, морфологические и биохимические свойства. Совершали посев каждого микроорганизма на чашки Петри в МПА в объеме 1 см3 в концентрации Salmonella enteritidis – 2,7х109 КОЕ/см3; Staphуlococcus aureus – 7,5х109 КОЕ/см3, Esсherichia coli – 6,9х109 КОЕ/см3, Pseudomonas aeruginosa – 3,6х109 КОЕ/см3. После застывания агара в нем вырезали лунки диаметром 5 мм. Для предупреждения подтекания масел под агар, на дно лунки вносили по 1 капле расплавленного мясо-пептонного агара. Эфирные масла в чистом виде вносили в лунки – один вид масла на чашку с одним видом микроорганизма в три лунки – 1, 2, 3. Контролем на каждой чашке служила лунка, заполненная стерильным физиологическим раствором. Посевы термостатировали 24 часа при температуре 37,0°С. Зону задержки роста измеряли линейкой.
С целью определения бактерицидной активности паров эфирных масел использовали метод, предложенный Maruzzella и др. в 1959 году . На поверхность МПА вносили смыв суточной культуры тест-микроорганизмов по 0,2 см3 в концентрации Salmonella enteritidis – 2,7х109 КОЕ/см3; Staphуlococcus aureus – 7,5х109 КОЕ/см3, Esсherichia coli – 6,9х109 КОЕ/см3, Pseudomonas aeruginosa – 3,6х109 КОЕ/см3, Pasteurella multocida – 1,2х105. Посевы подсушивали. На крышку чашки Петри наносили 0,2 мл эфирного масла и распределяли его шпателем по всей поверхности крышки. Чашки дном вверх помещали в термостат при температуре 37,0°С. Подсчет выросших колоний проводили через 24, 48, 72 часа. Все опытные серии сопровождались посевами указанных микроорганизмов без добавления эфирных масел, что служило контролем в проведенном исследований.
Числовые данные обрабатывали статистически. При сравнении средних величин в нормально распределенных совокупностях количественных данных рассчитывали t-критерий Стьюдента. Полученные значения t-критерия Стьюдента оценивали путем сравнения с критическими значениями. Различия показателей считали статистически значимыми при уровне значимости p≤0,05.
3. Основные результаты
При изучении антимикробной активности масел нами был использован метод, основанный на диффузии эфирного масла в толщу агаровой среды, содержащей тест-культуру и подавление роста последней. Полученные нами результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Диаметр зоны задержки роста тест-микроорганизмов вокруг лунок с эфирными маслами (n=3)
№ п/п | Эфирное масло | Исследуемые тест-культуры, мм | |||
Pseudomonas aeruginosa | Staphylococcus aureus | Escherichia coli | Salmonella enteritidis | ||
1 | Кориандр | 0 | 12±0,5 | 0 | 11,0±0,3 |
2 | Пихта | 0 | 16±0,7 | 20 | 28±0,5 |
3 | Иссопа | 0 | 9 | 0 | 0 |
4 | Герань | 0 | 9±0,3 | 9 | 0 |
5 | Кипарис | 7±0,3 | 19±0,5 | 23±1,6 | 21,0±1,3 |
6 | Можжевельник | 0 | 18±0,5 | 14 | 14±0,7 |
7 | Сосна | 0 | 10±0,3 | 12±0,5 | 18±0,5 |
8 | Мята | 0 | 9±0,5 | 0 | 8±0,3 |
9 | Розмарин | 0 | 11±0,3 | 0 | 8 |
10 | Горная Лаванда | 0 | 9 | 0 | 0 |
11 | Шалфей | 0 | 0 | 0 | 0 |
12 | Кедр | 0 | 11±0,3 | 19±1,0 | 30±0,5 |
13 | Эвкалипт | 10±0,3 | 12±0,6 | 12 | 13 |
В ходе эксперимента установили, что тест-культура Pseudomonas aeruginosa методом лунок была устойчива к большей части эфирных масел и проявляла чувствительность только к двум эфирным маслам – кипариса и эвкалипта (рис. 3). Все исследуемые масла, кроме шалфея, обладали высокой бактерицидной активностью в отношении Staphylococcus aureus. Масла кипариса, можжевельника и пихты образовывали зону задержки роста тест-микроорганизма вокруг лунок до 19, 18 и 16 мм соответственно (рис. 2). E. coli в данном опыте была устойчива к половине исследуемых масел (рис. 5). Наибольшую зону задержки роста E. coli образовывали масла хвойных растений – пихты, кипариса и кедра. Ее диаметр составлял 20 мм, 23 мм и 19 мм соответственно. В отношении Salmonella enteritidis эфирные масла хвойных растений – пихты, кипариса, сосны и кедра также были более эффективны по сравнению с другими маслами (рис. 4). Диаметр зоны задержки роста Salmonella enteritidis вокруг лунки с маслом кедра составлял 30 мм. Результаты исследований по определению зоны задержки роста тест-микроорганизмов вокруг лунок с эфирными маслами представлены в виде графика (рис. 1).
Рисунок 1 - Диаметр зоны задержки роста тест-микроорганизмов вокруг лунок с эфирными маслами (n=3)
Рисунок 2 - Зона задержки роста Staphylococcus aureus вокруг лунок с эфирными маслами
Примечание: 1 – масло розмарина, 2 – шалфея, 3 – кориандра, 4 – горной лаванды, 5 – иссопа, 6 – мяты, 7 – сосны, 8 – кедра, 9 – пихты, 10 – кипариса, 11 – можжевельника
Рисунок 3 - Зона задержки роста Pseudomonas aeruginosa вокруг лунок с эфирными маслами
Примечание: 1 – масло можжевельника, 2 – кипариса, 3 – иссопа, 4 – герани, 5 – розмарина, 6 – шалфея, 7 – кориандра, 8 – пихты, 9 – горной лаванды, 10 – сосны
Рисунок 4 - Зона задержки роста Salmonella enteritidis вокруг лунок с эфирными маслами
Примечание: 1 – масло горной лаванды, 2 – розмарина, 3 – иссопа, 4 – мяты, 5 – шалфея, 6 – герани, 7 – кедра, 8 – можжевельника, 9 – кориандра, 10 – сосны, 11 – пихты
Рисунок 5 - Зона задержки роста Escherichia coli вокруг лунок с эфирными маслами
Примечание: 1 – масло горной лаванды, 2 – розмарина, 3 – герани, 4 – шалфея, 5 – кориандра, 6 – иссопа, 7 – сосны, 8 – мяты, 9 – кедра, 10 – пихты, 11 – можжевельника
Таблица 2 - Действие паров эфирных масел на рост тест-микроорганизмов (n=3)
Вид масла | Pseudomonas aeruginosa | Staphylococcus aureus | Escherichia coli | Salmonella enteritidis |
контроль | ||||
3,6±0,51x109 | 7,5±0,63x109 | 6,9±1,09x109 | 2,7±0,32x109 | |
Кориандр | 5,0±0,4 x108* | нет роста | нет роста | 7,1±0,75х103* |
Пихта | 2,0±0,41x109 | нет роста | нет роста | 3,3±0,62x108* |
Иссопа | 6,5±0,86x108* | нет роста | 3,5±0,95x107* | 2,8±0,92x105* |
Герань | 2,1±0,32x109 | нет роста | 4,0±0,81x109 | 2,6±0,77x109 |
Кипарис | 2,1±0,29x109 | 2,6±0,73х108* | 7,7±0,74x106* | 2,9±0,82x107* |
Можжевельник | 2,2±0,48x109 | 3,4±0,83х106* | 4,1±0,34x109 | 1,3±0,23x109*** |
Сосна | 2,4±0,07x109 | 1,9±0,49х109** | 6,1±0,88x109 | 2,0±0,43x109 |
Мята | 2,0±0,38x109 | нет роста | 5,0±0,59x108* | 1,1± 0,03x109** |
Розмарин | 1,7±0,14x109*** | 2,8±0,92х106* | 1,1±0,03x109* | 1,6± 0,4x109*** |
Горная лаванда | 2,2±0,36x109 | нет роста | 5,2±0,57x109 | 3,9± 0,35x108* |
Шалфей | 3,2±0,31x109 | 1,9±0,38х102* | 6,9±0,94x109 | 1,0±0,03x109*** |
Кедр | 1,0±0,3x109*** | 5,2±1,1х106* | 7,1±0,68x106* | нет роста |
Эвкалипт | 4,7±0,5х108* | 2,0±0,33х103* | 4,2±0,24х103* | 4,6±0,55х106* |
Примечание: * Р≤0,001; ** Р≤0,01; *** Р≤0,05
Установлено, что пары эфирных масел кориандра, пихты, иссопа, герани, мяты и горной лаванды полностью подавляли рост Staphylococcus aureus (рис. 6). А пары масел эвкалипта и шалфея снижали его рост в 3,7х106 и в 3,9х107 раза соответственно. Пары эфирных масел эвкалипта, иссопа и кориандра оказывали влияние на рост Pseudomonas aeruginosa, достоверно снижая рост в 7,6, в 5,5 и в 7,2 раза соответственно (рис. 7). Дезинфицирующим свойством в отношении Pseudomonas aeruginosa не обладало ни одно из исследуемых масел. Рост кишечной палочки полностью подавлялся парами эфирных масел кориандра и пихты (рис. 10). Пары эвкалипта снижали рост E. coli в 1,6х106, а кедра – в 971 раз (рис. 9). Образец эфирного масла кедра полностью подавлял рост Salmonella enteritidis (рис. 8), а пары масел кориандра, иссопа и эвкалипта обладали меньшей бактерицидной активностью и снижали рост сальмонелл в 3,8х105, в 9,6х103 и в 586 раз соответственно.
Рисунок 6 - Действие паров эфирных масел на рост Staphylococcus aureus (разведение 10-1)
Примечание: 1 – пары масла мяты, 2 – кориандра, 3 – горной лаванды, 4 – герани, 5 – пихты, 6 - контроль
Рисунок 7 - Действие паров эфирных масел на рост Pseudomonas aeruginosa (разведение 10-7)
Примечание: 1 – пары масла горной лаванды, 2 – сосны, 3 – герани, 4 – можжевельника, 5 – кипариса, 6 – мяты, 7 – кедра, 8 – иссопа, 9 – розмарина, 10 – пихты, 11 – кориандра, 12 – шалфея, 13 – контроль
Рисунок 8 - Действие паров эфирного масла кедра на рост Salmonella enteritidis (разведение 10-1)
Рисунок 9 - Действие паров эфирных масел на рост Escherichia coli (разведение 10-6)
Примечание: 1 – контроль, 2 – пары масла кипариса, 3 – горной лаванды, 4 – шалфея, 5 – розмарина, 6 – мяты, 7 – кедра, 8 – иссопа
Рисунок 10 - Действие паров эфирных масел на рост Escherichia coli (разведение 10-1)
Примечание: 1 – контроль, 2 – пары масла кориандра, 3 – пихты
4. Обсуждение
Проведенными исследованиями установлено, что S. aureus был более чувствителен к эфирным маслам, чем другие тест-культуры микроорганизмов. Это подтверждает сведения, что грамположительные бактерии более чувствительны к эфирным маслам, чем грамотрицательные . Низкую антибактериальную активность эфирных масел против грамотрицательных бактерий объясняют структурой внешней мембраны этих микроорганизмов, на которой гидрофильные цепи молекул полисахаридов образуют барьер для гидрофобных эфирных масел , . Однако наши исследования методом воздействия паров эфирных масел на тест-культуру показали, что масло кориандра и пихты в объеме 200 мкл полностью подавляло рост E. coli, а масло кедра – рост Salmonella enteritidis.
Проведенными исследованиями определено, что масла горной лаванды, герани и мяты образовывали одну из самых низких зон задержки роста S. aureus вокруг лунок с маслами – 9 мм, однако пары этих масел проявляли высокое бактерицидное действие и полностью подавляли рост золотистого стафилококка. И, напротив, масло кориандра не образовывало зоны задержки роста E. coli вокруг лунок, а пары этого масла полностью подавляли рост кишечной палочки. Также было отмечено, что вокруг лунок с маслом кипариса образовывалась значительная зона задержки роста E. coli в 23 мм, а действие паров на рост этой тест-культуры было сдерживающим и составило 7,7±0,74х106. Скорее всего это связано с различной способностью диффузии масел в агаре. Бактерицидное действие двумя методами подтверждалось у масла кедра в отношении S. enteritidis, а также у масла пихты в отношении E. coli. Масло кориандра и пихты показали наибольшую бактерицидную активность в отношении грамположительных и грамотрицательных тестируемых микроорганизмов.
5. Заключение
В ходе исследований установлено, что все исследуемые эфирные масла проявляли бактерицидную активность в отношении изучаемых микроорганизмов. Эфирные масла кориандра, пихты, иссопа, герани, мяты и горной лаванды в исследуемой концентрации полностью подавляли рост Staphylococcus aureus, а масла кориандра и пихты – рост Escherichia coli. Дезинфицирующим свойством в отношении Salmonella enteritidis обладали пары масла кедра. Рост Pseudomonas aeruginosa снижался под воздействием масел кориандра, иссопа, розмарина, кедра и эвкалипта.